李喜香, 畢映燕, 李季文, 劉效栓, 潘從澤, 牟倩倩

（甘肅省中醫(yī)院藥劑科, 甘肅 蘭州 730050）

正交試驗(yàn)優(yōu)選補(bǔ)腦軟膠囊水提乙醇沉降制備工藝

李喜香*, 畢映燕, 李季文, 劉效栓, 潘從澤, 牟倩倩

（甘肅省中醫(yī)院藥劑科, 甘肅 蘭州 730050）

目的 優(yōu)選補(bǔ)腦軟膠囊最佳水提乙醇沉降工藝。方法 以干膏率、阿魏酸、芍藥苷的量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選補(bǔ)腦軟膠囊的最佳水提工藝;選取濃縮液相對(duì)密度、醇沉?xí)r間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選補(bǔ)腦軟膠囊提取液的乙醇沉降工藝。結(jié)果 優(yōu)選的最佳提取工藝為加 12 倍量的水煎煮 3 次， 每次 1.5 h， 最佳醇沉工藝為濃縮液密度 1.15 g/mL， 乙醇體積分?jǐn)?shù)為 55%， 靜置 12 h。 結(jié)論 該工藝穩(wěn)定可行，可作為補(bǔ)腦軟膠囊工業(yè)化的提取工藝。

補(bǔ)腦軟膠囊;水提醇沉;正交試驗(yàn);阿魏酸;芍藥苷

補(bǔ)腦膏為甘肅省中醫(yī)院自制制劑，在古方佛手散的基礎(chǔ)上，重用甘肅道地藥材岷當(dāng)歸，配伍川芎、赤芍、黃芪、仙茅、淫羊藿、龜甲、甘草等中藥而成，具有益智醒腦、滋腎補(bǔ)髓之效［1］。 在治療腦炎， 腦膜炎后遺癥、 治療血管性癡呆［2-4］等方面具有較好的臨床療效。 補(bǔ)腦膏過(guò)去一直以膏滋應(yīng)用于臨床，儲(chǔ)存、運(yùn)輸、服用不便，為了方便該制劑在臨床上的使用，減少患者服藥劑量，增加患者順應(yīng)性，將其制成軟膠囊。根據(jù)處方中藥物所含成分的理化性質(zhì)及藥理效應(yīng)，采用正交試驗(yàn)法，對(duì)補(bǔ)腦軟膠囊的水提乙醇沉降工藝進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀 （ 美國(guó) Waters公司 1525 型），717 自動(dòng)進(jìn)樣器， 2487 雙通道紫外檢測(cè)器， breeze數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);METTLER AE240 型萬(wàn)分之一電子分析天平 （德國(guó)Sartorius公司） ， 十 萬(wàn) 分 之 一 分 析 天 平;HS6150 型 數(shù) 控 超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）;ZXFD-A5140 電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 試藥 當(dāng)歸、 赤芍、 川芎等 14 味藥材均購(gòu)于甘肅省中醫(yī)院，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院李成義教授鑒定為正品;阿魏酸（批號(hào) 110773-200611， 中國(guó)藥品生物制品檢定所）; 芍藥苷（批號(hào) 110736-200629， 中國(guó)藥品生物制品檢定所）。 乙腈（山東禹王集團(tuán)化工分公司生產(chǎn)， 色譜純）， 甲醇 （天津百世化工有限公司， 分析純）， 其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 水提取工藝正交試驗(yàn) 補(bǔ)腦軟膠囊有效部位主要為水溶性部分，故以水為溶媒。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間這三個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果影響較大，故對(duì)三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化， 每個(gè)因素設(shè) 3 個(gè)水平， 采用 L9（34） 正交表安排試驗(yàn)，以干膏率、芍藥苷、阿魏酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)其最佳提取工藝進(jìn)行考察， 正交設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

表1 水提工藝正交試驗(yàn)

2.1.2 醇沉工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 乙醇沉降工藝主要受到濃縮液相對(duì)密度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉?xí)r間的影響，故對(duì)三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化， 每個(gè)因素設(shè) 3 個(gè)水平， 采用 L9（34） 正交表安排試驗(yàn)，以干膏率、芍藥苷、阿魏酸轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)其最佳醇沉工藝進(jìn)行考察，分別按處方比例稱取各藥材9份，按水提最佳工藝進(jìn)行提取，按醇沉正交試驗(yàn)安排表進(jìn)行試驗(yàn)，按干膏率、芍藥苷、阿魏酸量的測(cè)定方法測(cè)定。 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表2 醇沉正交試驗(yàn)

2.2 干 膏率測(cè)定 按正交 試 驗(yàn) 所得的提 取 液 濃縮至100 mL， 精密吸取 10 mL， 置干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干， 殘?jiān)?105 ℃干燥至恒定質(zhì)量， 取出， 迅速至干燥器中冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，測(cè)定所得干膏率。

2.3 定量測(cè)定

2.3.1 色 譜 條 件 Waters C18柱 （ 250 mm ×4.6 mm，5 μm）， 以乙腈-0.1%磷酸 （18 ∶82） 為流動(dòng)相， 體積流量為 1 mL/min， 檢測(cè)波長(zhǎng)為 230 nm， 柱溫為室溫， 進(jìn)樣量10 μL。 理論塔板數(shù)均不低于 4 000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定對(duì)照品芍藥苷、 阿魏酸適量， 加甲醇溶解， 定容于 10 mL量瓶中， 制成質(zhì)量濃度分別為 1.224、 0.234 mg/mL的對(duì)照品溶液， 備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取各處方下提取液5mL， 水浴蒸干， 加 甲醇 25mL， 稱 定 質(zhì) 量， 超 聲 處 理40min， 稱定質(zhì)量， 補(bǔ)足減失質(zhì)量， 用 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

2.3.4 陰性樣品制備 按照補(bǔ)腦軟膠囊的處方制備不含當(dāng)歸、赤芍、 川穹的樣品， 按 “2.3.3” 項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 取 “2.3.2” 項(xiàng)下的對(duì)照品 “2.3.3” 項(xiàng)供試品、 “2.3.4” 項(xiàng)下陰性樣品溶液各10 μL， 按 “2.3.1” 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，芍藥苷、阿魏酸和供試品中其他組分色譜峰可達(dá)到良好分離，陰性樣品溶液對(duì)三者的測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 芍藥苷、 阿魏酸高效液相色譜圖

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取已配制好的 2 種有效成分標(biāo)樣貯備液適量， 加甲醇制成每 1 mL含芍藥苷 0.030 6、0.076 5、 0.153 0、 0.306 0、 0.459 0、 0.612 0mg， 阿魏酸0.004 7、 0.011 7、 0.023 4、 0.046 8、 0.070 2、 0.093 6mg標(biāo)樣溶液， 10 μL進(jìn)樣， 每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣 3 次， 按“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件測(cè)定， 以峰面積 （Y） 為縱坐標(biāo)， 質(zhì)量濃度 （X） 為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 芍藥苷回歸方程為 Y=2 ×107X-18 304 （r=0.999 9）; 阿魏酸回歸方程為Y=3 ×107X+12 231 （r=0.999 9）， 芍藥苷、 阿魏酸在選定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液10 μL， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 記錄峰面積， 芍藥苷、 阿魏酸 RSD分別為 0.5%、 0.7%。

精密吸取一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液 10 μL， 連續(xù) 3日內(nèi)每日進(jìn)樣2 次， 記錄峰面積， 芍藥苷、 阿魏酸 RSD分別為 1.3%、 0.9%。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液分別在 0、4、 8、 12、 18、 24 h 進(jìn)樣10 μL， 記錄峰面積， 芍藥苷、 阿魏酸 RSD分別為 1.0%、 1.9%。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液 6 份， 按“2.3.3” 項(xiàng)下樣品處理方法處理， 進(jìn)樣 10 μL， 記錄峰面積。供試品中芍藥苷、 阿魏酸 RSD分別為1.2%、 1.7%。

2.3.10 加樣回收率 精密吸取已知含有量的提取液 2.5 mL， 分別加入等量的對(duì)照品， 按 “2.3.3” 項(xiàng)下樣品處理方法處理， 按 “2.3.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定， 芍藥苷、阿魏酸的平均加樣回收率分別為 100.3%、 98.45%， RSD分別為 2.4%、 1.2%。

2.3.11 樣品測(cè)定 精密吸取正交試驗(yàn)安排表下各樣品適量， 按 “2.3.3” 項(xiàng)下樣品處理方法處理后， 用 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾， 取續(xù)濾液 10 μL， 進(jìn)樣分析， 按外標(biāo)法計(jì)算樣品中芍藥苷、阿魏酸的量。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 水提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 采用綜合評(píng)分法進(jìn)行分析， 用 L9（34） 正交表進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)選， 對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析， 結(jié)果見(jiàn)表3、 表4。

表3 水提取工藝正交試驗(yàn)直觀分析

表4 水提取工藝方差分析

對(duì)干膏率、阿魏酸、芍藥苷的量進(jìn)行綜合評(píng)分，由極差分析可知， 各因素對(duì)提取工藝的影響順序?yàn)锳＞B＞C， 即提取次數(shù)＞加水量 ＞提取時(shí)間; 數(shù)值直觀分析表明 A3＞A2＞ A1， B3＞B2＞B1， C2＞C1＞C3， 選取的提取方式為 A3B3C2。方差分析結(jié)果表明，B因素對(duì)提取工藝具有顯著性影響，故選擇 B3。 A因素對(duì)提取工藝的影響大于 C因素， 考慮 A、 C因素對(duì)工藝影響甚小，但從不影響干膏率及有效成分的量方面綜合考察， 選擇的最佳工藝為加12倍量的水， 提取3 次，每次 1.5 h， 作為補(bǔ)腦膏軟膠囊最佳提取工藝。

2.4.2 醇沉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 采用綜合評(píng)分法進(jìn)行分析， 用 L9（34） 正交表進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)選， 對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析， 結(jié)果見(jiàn)表5、 表6。

表5 醇沉正交試驗(yàn)直觀分析

表6 醇沉試驗(yàn)方差分析

對(duì)干膏率、阿魏酸、芍藥苷轉(zhuǎn)移率進(jìn)行綜合評(píng)分，由極差分析可知，各因素對(duì)提取工藝的影響順序?yàn)锳＞B＞C， 即濃縮液相對(duì)密度 ＞乙醇體積分?jǐn)?shù) ＞醇沉?xí)r間; 數(shù)值直觀分析表明 A3＞A2＞A1， B2＞B3＞B1， C3＞C1＞C2， 選取的提取方式為 A3B2C3。 方差分析結(jié)果表明， A、 B因素對(duì)提取工藝具有顯著性影響， 故選擇 A3B2。 C因素對(duì)提取工藝的影響無(wú)顯著性差異， 為了提高生產(chǎn)效率， 選擇 C1，因此選擇的最佳工藝為 A3B2C1， 將提取液濃縮至 1.15 g/ mL， 加入一定量乙醇使其醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 55%， 靜置 12 h， 作為補(bǔ)腦軟膠囊最佳醇沉工藝。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.5.1 水提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取全方藥材 3 份 （每份525 g）， 按照正交試驗(yàn)結(jié)果所確定的最佳提取工藝提取，按 “2.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定干膏率、 按 “2.3” 項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定提取液中芍藥苷、阿魏酸的量。 結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 水提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

2.5.2 醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取全方藥材 3 份 （每份525 g）， 加12 倍量的水， 煎煮提取3 次， 每次1.5 h， 合并濾液， 濃縮至密度 1.15 g/mL， 用 95%乙醇將其乙醇體積分?jǐn)?shù)調(diào)整至 55%， 靜置 12 h， 分離上清液， 回收至無(wú)醇味， 按 “2.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定干膏率、 按 “2.3” 項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定醇沉液中阿魏酸、芍藥苷的量，計(jì)算其轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

補(bǔ)腦軟膠囊是在甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑補(bǔ)腦膏基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行劑型改進(jìn)，其中當(dāng)歸、川芎、赤芍為其主藥，工藝考察選取干膏率， 當(dāng)歸、 川芎中阿魏酸［5-8］， 赤芍中芍藥苷［9］的量作為其評(píng)價(jià)指標(biāo)， 并給予干膏率 0.2， 阿魏酸、芍藥苷分別 0.4 的權(quán)重系數(shù)， 進(jìn)行綜合評(píng)分， 優(yōu)選制備工藝。為了保證醇沉?xí)r盡量除去雜質(zhì)，同時(shí)減少有效成分的損失，對(duì)補(bǔ)腦軟膠囊的醇沉工藝進(jìn)行了研究，考察過(guò)程中以一定乙醇體積分?jǐn)?shù)下醇溶物量以及有效成分的轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo)，全面評(píng)價(jià)其精制工藝。通過(guò)多指標(biāo)綜合評(píng)分選取的提取醇沉工藝重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，為其規(guī)范化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

本研究同時(shí)測(cè)定阿魏酸與芍藥苷的量，達(dá)到同時(shí)控制處方中三種藥材的目的。在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，同時(shí)測(cè)定二者含有量的文獻(xiàn)已有報(bào)道［10-16］， 文獻(xiàn)中以 230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)， 故本實(shí)驗(yàn)也在 230 nm處進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果二者響應(yīng)信號(hào)良好。阿魏酸為酸性物質(zhì)，在酸性流動(dòng)相條件下可完全游離， 分離度較高。 因此選擇乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相，二者達(dá)到良好分離。

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蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2012-2-78）

李喜香 （1968—）， 女， 主任中藥師， 研究方向: 中藥制劑工藝。 Tel:15002550389， Email:lixixiang929@163.com