高建德, 劉 雄*, 范凌云, 余 琰, 馬 騰

（甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州730000）

肉蓯蓉酶解提取工藝及抗氧化活性研究

高建德1, 劉 雄1*, 范凌云2, 余 琰2, 馬 騰3

（甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州730000）

目的 研究復(fù)合酶提取肉蓯蓉的工藝;比較傳統(tǒng)水提、醇提與酶解后水提、醇提，正丁醇萃取物抗氧化活性。方法 以肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間為主要因素，通過正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶提取肉蓯蓉的最佳工藝條件，并在此基礎(chǔ)上，比較不同提取方法下提取物抗氧化活性。結(jié)果 復(fù)合酶強(qiáng)化提取肉蓯蓉最佳工藝參數(shù)為復(fù)合酶 0.2%、 酶解溫度 60 ℃， 酶解時(shí)間 2.5 h; 等量藥材同體積肉蓯蓉提取液， 抗氧化活性依次為:酶解后醇提＞酶解后水提＞傳統(tǒng)醇提＞傳統(tǒng)水提。結(jié)論 在所得的復(fù)合酶提取肉蓯蓉工藝條件下，肉蓯蓉抗氧化活性可以顯著提高。

肉蓯蓉;復(fù)合酶;提取工藝;抗氧化活性

肉蓯蓉 Cistanche deserticola YC.Ma是我國傳統(tǒng)名 貴中藥材， 具有補(bǔ)腎陽、 益精血、 潤腸通便的功效［1］。 當(dāng)前，評(píng)價(jià)肉蓯蓉質(zhì)量主要是對 《中國藥典》 規(guī)定的指標(biāo)成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的量進(jìn)行檢定，近代藥理學(xué)研究也表明，該藥材中的松果菊苷和毛蕊花糖苷能提高機(jī)體免疫功能， 促進(jìn) DNA合成， 增強(qiáng)體力， 提高智能， 具有明顯的抗衰老作用［2-3］。 自由基具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性， 其過多或清除過慢， 都會(huì)加速機(jī)體衰老， 并且會(huì)誘發(fā)多種疾?。?］。鐵氰化鉀法總還原力測定、 DPPH·（二苯代苦味酰自由基）分析法被廣泛用于抗氧化活性研究，是用以評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏可行的方法［5］。

酶技術(shù)是近年來用于天然植物有效成分提取的一項(xiàng)生物工程技術(shù)。通過選用一些恰當(dāng)?shù)拿割?，使?xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)降解，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減小細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，從傳質(zhì)角度促使有效成分提取率提高［6］。 為了更好地開發(fā)利用這一珍貴的資源， 本實(shí)驗(yàn)在纖維素酶提取肉蓯蓉中苯乙醇苷［7］、 果膠酶酶解研究基礎(chǔ)上，將纖維素酶與果膠酶按一定比例混合制成復(fù)合酶，并對復(fù)合酶提取肉蓯蓉工藝進(jìn)行優(yōu)選，在酶解強(qiáng)化提取基礎(chǔ)上，將傳統(tǒng)水提、醇提及酶解強(qiáng)化水提、醇提進(jìn)行了抗氧化活性研究，以便為肉蓯蓉科學(xué)生產(chǎn)合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

肉蓯蓉購于甘肅省安寧醫(yī)藥公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院鑒定教研室楊扶德老師鑒定為列當(dāng)科植物肉蓯蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。 松 果菊苷對照品 （購于中國食品藥品檢定研究院， 批號(hào) 111670-200503）;毛蕊花糖苷對照品 （購于中國食品藥品檢定研究院， 批號(hào)111530-200303） ;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （ 純度 ＞96%，Sigma公司）; 正丁醇 （分析純）; 甲醇、 乙腈、 醋酸 （ 色譜純）;95%乙醇 （色譜純）; 纖維素酶、 果膠酶均購于寧夏和氏壁生物技術(shù)有限公司。

Waters高效液相色譜儀 （美國， 1525 型輸液泵， 2487型紫外檢測器， 2996 型檢測器， 717 自動(dòng)進(jìn)樣器， waterts Empower色 譜 軟 件）;UV1800PC 型 紫 外 分 光 光 度 計(jì); FA1604s電子天平;DD-5M型湘液離心機(jī);DZF-6051 型空干燥箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取物測定

2.1.1 色譜條件 檢測波長為 334 nm; 流動(dòng)相為乙腈-甲醇-1%醋酸 （10 ∶15 ∶75）， 體積流量 1 mL/min， 等度洗脫;Agilent HC-C18色譜柱 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） 。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取松果菊苷 10.00 mg， 毛蕊花糖苷 10.00 mg， 用流動(dòng)相定容至 50 mL， 作為對照品貯備液。

2.1.3 供試品溶液制備 取 20 g肉蓯蓉藥材， 精密稱定，浸泡一定時(shí)間， 加 8倍量水煎煮 2次， 每次 2 h， 合并煎液，濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉(zhuǎn)移至 50 mL量瓶中， 加流動(dòng)相至刻度， 貯備待用。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別將松果菊苷、 毛蕊花糖苷貯備液移取2mL至10mL量瓶中， 用流動(dòng)相定容， 作為對照品使用。 分別進(jìn) 樣 1、 2、 4、 8、 10、 20 μL， 將 進(jìn)樣量 X（μg） 和峰面積 Y做線形回歸。 結(jié)果松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=6.89 ×105X-6.67 ×104， r=0.999 9; 毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=5.74 ×105X-6.69 ×104， r= 0.999 9。 表明松果菊苷和毛蕊花糖苷均在 0.2 ～14.0 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度考察 同一供試品溶液， 連續(xù)進(jìn)樣 5 次， 測得松果菊苷峰面積的 RSD為 1.6%， 毛蕊花糖苷的 RSD為 1.8%。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液， 按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備5份溶液，以上述色譜條件測定，松果菊苷峰面 積 的 RSD 為 1.3%， 毛 蕊 花 糖 苷 峰 面 積 的 RSD為 1.9%。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取 6 個(gè) 25mL量瓶， 從用酶解強(qiáng)化水提的肉蓯蓉樣品液中吸取 1.00、 2.00、 3.00 mL于前3個(gè)量瓶中，后3個(gè)量瓶中加入同樣多的樣品液，然后分別精密加入相應(yīng)的對照品溶液，各份均按上述測定方法進(jìn)行測定，測得松果菊苷和毛蕊花糖苷的加樣回收率分別為98.9%和 97.8%， RSD分別為 1.9%和 1.8%。

2.1.8 樣品測定 分別稱取肉蓯蓉藥材粉末 20 g， 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 測定對照品及供試品， 結(jié)果見圖 1、 圖 2。

圖1 混合對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 復(fù)合酶提取正交試驗(yàn)方案 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上， 發(fā)現(xiàn)纖維素酶用量在 0.1%， 果膠酶用量在 0.15%時(shí)對肉蓯蓉提取影響較為顯著 （另文發(fā)表）， 故為簡化實(shí)驗(yàn)過程，在正交優(yōu)化試驗(yàn)過程中， 按照復(fù)合酶 （纖維素酶 ∶果膠酶 =2 ∶3） 配比， 并按表 1 設(shè)計(jì)選擇不同酶用量、 酶解時(shí)間、 酶解溫度進(jìn)行酶解， 酶解后水提2次， 每次2 h， 提取液濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏，完全轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中， 加流動(dòng)相至刻度， 按正交試驗(yàn)要求共得到 9 份樣品液， 分別用 0.45 μm微孔濾膜濾過定容至10 mL量瓶， 標(biāo)注為樣品液1 ～9 號(hào)， 測定各樣品中松果菊苷和毛蕊花糖苷的量，計(jì)算其提取率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.3 提取物的抗氧化活性測定方法

2.3.1 總還原力測定 （鐵氰化鉀法［8］） 取試樣 2mL， 加2.5mL pH 6.6 磷酸緩沖溶液、 2.5 mL 1% 鐵氰化鉀， 混合物在 50 ℃恒溫條件下， 加熱 20 min。 急速冷卻， 加 2.5 mL 10%三氯乙酸， 混勻后以 3 000 r/min 離心 10min。 取上層清液 2.5mL， 加 2.5mL蒸餾水再加 0.5mL 0.1%FeCl3， 混合均勻， 靜置 10min 后， 在 700 nm處測定吸光度。

2.3.2 提取物 DPPH·清除活性測定［5］精密稱取 DPPH 4.4mg用 95%乙醇溶解并定容至 100 mL， 得 DPPH溶液。取試樣 2 mL加 DPPH溶液 2 m L， 在室溫下反應(yīng) 30 min 后于 517 nm處測定吸光度 （Ai）; 同時(shí)測定 DPPH乙醇溶液 2 mL和 95%乙醇 2 mL的吸光度 （AO） 及各樣品液 2 mL分別加 95%乙醇 2 m L的吸光度 （Aj）。 各吸光度值平行測定3 次， 取其平均值。 按下式計(jì)算 DPPH·清除率。

DPPH·清除率（%） = ［1- （ Ai-Aj） /AO］ ×100

3 不同提取方法抗氧化活性

3.1 酶解強(qiáng)化水提 準(zhǔn)確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時(shí)間，按已優(yōu)化復(fù)合酶酶解工藝酶解，藥渣加8倍量水煎煮2次， 每次2 h， 合并藥液， 濃縮至浸膏， 加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉(zhuǎn)移至 50 mL量瓶中， 加95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、6.00、 8.00mL置于 25 mL量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質(zhì)量濃度 （換算成生藥材質(zhì)量濃度分別為 0.016、0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/mL） 的溶液， 按照總還原力測定、 DPPH·方法測定。

3.2 酶解強(qiáng)化醇提 準(zhǔn)確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時(shí)間，按已優(yōu)選復(fù)合酶酶解工藝酶解，藥渣加8倍量75%乙醇回流提取 2 次， 每次 2 h， 合并藥液， 濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色， 正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中， 加 95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于 25 mL量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質(zhì)量濃度 （換算成生藥材質(zhì)量濃度分別為 0.016、 0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/mL） 的溶液， 按照總還原力測定、 DPPH·方法測定。

3.3 傳統(tǒng)水提 準(zhǔn)確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時(shí)間， 濾過， 藥渣加 8倍量水煎煮 2次， 每次 2 h， 合并藥液，濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉(zhuǎn)移至 50 mL量瓶中， 加 95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于25 mL量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質(zhì)量濃度 （換算成 生 藥 材 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 0.016、 0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/m L） 的 溶 液， 按 照 總 還 原 力 測 定、DPPH·方法測定。

3.4 傳統(tǒng)醇提 準(zhǔn)確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時(shí)間， 濾過， 藥渣加 8 倍量 75%的乙醇回流提取 2 次， 每次2 h， 合并藥液， 濃縮至浸膏， 加少量的熱水混懸， 依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉(zhuǎn)移至 50 mL量瓶中， 加 95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于25 m L量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質(zhì)量濃度 （換 算 成 生 藥 材 濃 度 分 別 為 0.016、 0.032、 0.064、0.096、 0.128 g/mL） 的 溶 液， 按 照 總 還 原 力 測 定、DPPH·方法測定。

4 結(jié)果與分析

4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表 2， 方差分析見表 3、 表 4。

表 2 正交試驗(yàn)結(jié)果 （n=3）

表3 松果菊苷得率方差分析

表4 毛蕊花糖苷得率方差分析

從表2直觀分析可知，各因素對肉蓯蓉提取松果菊苷得率和毛蕊花糖苷的影響程度為B＞C＞A， 初步認(rèn)為工藝條件最佳組合為 A3B2C3。 方差分析結(jié)果表明酶解時(shí)間（B） 具有顯著意義。 綜合分析， 確定最佳提取工藝條件是溫度 60 ℃， 酶解時(shí)間 2.5 h， 酶用量為 0.2%。

4.2 抗氧化活性結(jié)果 由圖 3、 圖 4 可知， 肉蓯蓉傳統(tǒng)水提、醇提物及酶解后水提、醇提物均具有一定的抗氧化活性，但在同一體積，同一批號(hào)藥材，相同生藥材質(zhì)量濃度下， 4 種不同提取方法以酶解后用 75%乙醇提取鐵氰化鉀總還原力所表征的吸光度最大， （DPPH·）自由基清除率也最大。 鐵氰化鉀總還原力、 （DPPH·）自由基清除率所表現(xiàn)出的順序?yàn)槊附夂蟠继幔久附夂笏幔敬继幔舅帷?/p>

5 討論

圖3 鐵氰化鉀法總還原力測定

圖4 提取物 DPPH·清除活性測定

中藥有效成分的提取和分離直接關(guān)系到其制劑的質(zhì)量和療效，隨著中藥提取領(lǐng)域新技術(shù)的不斷應(yīng)用，中藥提取技術(shù)有了極大飛躍，新技術(shù)具有效率高、耗能低等明顯優(yōu)勢。 作為國家二級(jí)保護(hù)植物， 并收入 《國際野生植物保護(hù)名錄》 和瀕危動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約 （CITES） 附錄二的肉蓯蓉［9］， 提高其利用率， 節(jié)約其資源， 成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。 孫萍等［10］采用微波提取技術(shù)對肉蓯蓉中總黃酮和多糖進(jìn)行了提取研究，結(jié)果提取周期縮短，提取效率提高。 歐陽杰等［11］采用超聲集成技術(shù)研究了肉蓯蓉中有效成分苯乙醇糖苷類化合物、甜菜堿和肉蓯蓉多糖的提取方法。 生物酶技術(shù)自 20 世紀(jì) 90 年代用于中藥提取中以來，產(chǎn)生了顯著性效 益， 已 在 中藥生物堿［12］、 黃酮［13］、 香豆素［14］、 多糖［15］、 皂苷［15］提取 等方面均有 報(bào)道。 但有 關(guān)肉蓯蓉酶解技術(shù)的報(bào)道甚少，課題組以肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了纖維素酶和果膠酶按一定比例混合提取肉蓯蓉的最佳條件，并對酶解后醇提、酶解后水提、醇提、水提抗氧化活性作了對比分析，結(jié)果表明，肉蓯蓉經(jīng)復(fù)合酶輔助單元提取后，可使其中松果菊苷和毛蕊花糖苷提取率明顯提高;抗氧化方面表現(xiàn)出的是，酶解后肉蓯蓉采用醇提較傳統(tǒng)醇提抗氧化能力顯著提高，且由曲線中點(diǎn)的變化來看，肉蓯蓉提取物的添加量在一定實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)與其抗氧化性呈正相關(guān)。

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R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2621-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.042

2013-09-13

甘肅省 2010 年度中醫(yī)藥英才基金 （ GZK-2010-55） ;2011 年度甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目 （ ZQ2011-7）

高建德 （1980—）， 男， 碩士， 副教授， 主要從事中藥制劑新技術(shù)與新劑型研究。 Tel:13919124704， E-mail:namegaojiande -2005@163.com

*通信作者: 劉 雄， 男， 教授， 碩士生導(dǎo) 師， 主要 從事 中藥有 效成 分與 質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)研 究。 Tel: （0931） 8765391， E-mail:lx@gszy. edu.cn