柯仲成, 胡善慶, 方 超, 朱志平, 徐志遠(yuǎn)

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室, 安徽 黃山 245041）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉三萜酸提取工藝研究

柯仲成, 胡善慶, 方 超, 朱志平, 徐志遠(yuǎn)

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室, 安徽 黃山 245041）

目的 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉中三萜酸的提取工藝。 方法 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、 料液比和提取時(shí)間為自變量，三萜酸得率為因變量，通過(guò)自變量與因變量的二次響應(yīng)面的回歸擬合，優(yōu)化提取工藝并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果最佳提取工藝為 14.4 倍量 82%乙醇， 提取 2 次， 每次 155 min。 結(jié)論 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選枇杷葉三萜酸的提取工藝，方法簡(jiǎn)便，精度高，預(yù)測(cè)性優(yōu)。

枇杷葉、星點(diǎn)設(shè)計(jì)、三萜酸、提取工藝

枇杷葉為薔薇科植物枇杷 Eriobotrya japonica Lind 的干燥葉，為傳統(tǒng)中草藥，性寒味苦，具有止咳平喘，清肺和胃，降氣化痰的功效，其主要成分有三萜酸類、黃酮類、揮發(fā)油、多酚類等。其中三萜酸類成分主要有熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸和山楂酸等，這些成分具有明顯的降血糖［1-2］、 抑制肺纖維化［3-4］和抗腫瘤［5-6］等藥理活性。

近年來(lái)，在中藥材提取工藝優(yōu)化上，主要有正交設(shè)計(jì)法和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法兩種方法， 也能獲得較好的工藝參數(shù)。相對(duì)而言，正交設(shè)計(jì)的應(yīng)用更久、更為廣泛，但星點(diǎn)設(shè)計(jì)作為一種相對(duì)較新的方法，隨著研究的逐漸深入，在中藥提取等相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用也迅速增加。目前，已有正交設(shè)計(jì)考察枇杷葉總?cè)扑崽崛」に嚨难芯繄?bào)道［7-8］， 尚未見(jiàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉三萜酸的提取工藝研究。 本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法［9-12］優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的正交設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較，以期能獲得較高的枇杷葉三萜酸得率，以便能在藥品、保健品等領(lǐng)域有更好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

1 儀器與試藥

KQ-100VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器 （ 昆山超聲）; T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （北京普析）;GZX—MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 （上海博訊）;AUY220 分析天平 （日本島津）。

熊果酸對(duì)照品 （上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)110106）; 枇杷葉 （2013 年 5 月采自安徽歙縣漳潭）; 其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 三萜酸測(cè)定方法的建立

2.1.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取 4.7mg熊果酸對(duì)照品， 用甲醇溶解， 轉(zhuǎn)移至 100 mL量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 定容， 即得質(zhì)量濃度為 47 μg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 樣品溶液的配制 稱取 10 g枇杷葉， 粗碎， 置于500 mL圓底燒瓶中， 乙醇回流提取， 合并濾液， 減壓回收至無(wú)醇味，石油醚脫脂，再用水飽和正丁醇萃取，濃縮，減壓干燥， 得枇杷葉提取物。 精密稱定 10 mg， 用適量甲醇溶解， 并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中， 定容， 備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取質(zhì)量濃度為 47 μg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2 mL， 分別置于 6 個(gè)蒸發(fā)皿中， 80 ℃水浴揮干， 加 5%香草醛-冰醋酸0.4 mL， 加高氯酸 0.8 mL， 60 ℃水浴加熱 15 min， 冰浴冷卻后， 加冰醋酸 5.0 mL， 搖勻， 于 545 nm處測(cè)定吸光度［13］， 以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)， 吸光度為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 所得的回歸方程為 Y=0.013 9X+0.133 3， r= 0.999 1， 表明樣品在 9.4 ～47.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取 2.0 mL樣液 6 份， 分別加入質(zhì)量濃度為 9.4 μg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0、 2.0、3.0 mL（各 2 份）， 按 “2.1.3” 項(xiàng)方法操作并測(cè)定吸光度， 計(jì)算得加樣回收率為 100.3%。

2.2 枇杷葉三萜酸提取工藝優(yōu)化

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 參考文獻(xiàn) ［14-15］ 并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)可知，影響回流提取枇杷葉三萜酸的主要因素有:乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)等。由于提取次數(shù)不是一個(gè)連續(xù)變量因素， 不易處理［16］， 故先將其固定為2。在效應(yīng)面設(shè)計(jì)思路的指導(dǎo)下，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)、 料液比和提取時(shí)間等3個(gè)因素，并將每因素設(shè)置3個(gè)水平，分別用代碼值 -1.682、 0、 1.682 來(lái)表示。 代碼值所代表的實(shí)際操作值見(jiàn)表 1， 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表 2。

表1 各因素與水平的代碼值與實(shí)際值對(duì)照

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 數(shù)學(xué)模型擬合 利用 Design-Expert 7.1.3 軟件， 將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行效應(yīng)面分析， 以枇杷葉中三萜酸得率 （Y）為效應(yīng)值， 分別對(duì) X1、 X2、 X3三個(gè)因素， 分別進(jìn)行二項(xiàng)式方程和多元線性方程擬合，發(fā)現(xiàn)利用二項(xiàng)式方程擬合較優(yōu)，得方程如下:

考慮其中有些為 t檢驗(yàn)不顯著項(xiàng)， 將其刪除， 得到二項(xiàng)式方程簡(jiǎn)化式:

從表3中方差分析可知，除乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間等3個(gè)因素各自對(duì)枇杷葉三萜酸得率有極顯著影響 （P＜0.01）， 料液比和提取時(shí)間的相互作用也對(duì)枇杷葉三萜酸得率有顯著的相互影響 （P＜0.05）。 而乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間則無(wú)顯著的相互影響 （P＞ 0.05）。 因此， 該方程能比較準(zhǔn)確地闡述枇杷葉三萜酸隨各個(gè)因素的變化趨勢(shì)，具有很好的預(yù)測(cè)指導(dǎo)性。

2.2.3 提 取工藝優(yōu)化 和預(yù)測(cè) 利 用軟件 （ Design-Expert 7.1.3）， 按照二項(xiàng)式方程的數(shù)學(xué)模型， 繪制枇杷葉三萜酸得率 （Y） 與 X2、 X3等 2 個(gè)變量的三維效應(yīng)曲面圖及等高曲線， 見(jiàn)圖1。

利用此數(shù)學(xué)模型， 可以預(yù)測(cè)在最優(yōu)提取工藝 （14.38倍量的81.89%乙醇， 提取2 次， 每次2.59 h） 條件下， 回流提取枇杷葉三萜酸， 得率最大值為 3.45%。

表3 方差分析

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 以預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取條件為基礎(chǔ)， 基于方便操作的原則， 將工藝條件微調(diào)為14.4 倍量82%乙醇， 提取 2 次， 每次 155 min， 進(jìn)行 3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)， 測(cè)定并計(jì)算枇杷葉三萜酸得率分別為 3.38%、 3.35%、 3.42%， 平均值為 3.38%， RSD為 3.5%。 說(shuō)明所建立的數(shù)學(xué)模型具有可靠的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件具有較高的重現(xiàn)性。

3 討論

雖然三萜酸具有降血脂、降血糖和抗腫瘤等作用，在枇杷葉中含有量較高，但對(duì)其提取工藝研究卻較少，且大部分都為利用正交原理篩選工藝參數(shù)。 根據(jù)參考文獻(xiàn) ［8］的最佳提取工藝 （以 6 倍量和 4 倍量的 80%乙醇提取兩次， 1.5 h/次）， 進(jìn)行了提取試驗(yàn)， 通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)三萜酸平均得率為 3.16%， 稍低于本研究?jī)?yōu)化的 3.38%， 有少許的差別 （RSD=6.96%）， 所以本研究的工藝參數(shù)雖可以獲得稍高的三萜酸得率，但在提取溶劑方面消耗較大。因而這兩種工藝參數(shù)各有優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際需要，選擇合適的提取條件。

圖 1 X2X3相互作用對(duì) Y的三維效應(yīng)面和二維等高線曲線圖

一般而言， 采用非線性數(shù)學(xué)模型星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，充分考慮各個(gè)因素之間的相互影響，可以提高預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性，是被一些科研工作者認(rèn)為優(yōu)于正交設(shè)計(jì)的原因所在，其實(shí)并不盡然，其實(shí)正交設(shè)計(jì)如果在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置合理的因素與水平，同樣也一定可以獲得很好的工藝參數(shù)和較優(yōu)的提取效果。

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:B

1001-1528（2014）12-2618-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.041

2013-08-17

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 （KJ2014A242）; 國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 （201210375034）; 安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （1308085QH139）

柯仲成 （1981—）， 講師， 研究方向: 中藥新劑型。 E-mail:xiaoke1020@126.com