李 曄, 孫 雯, 蔣 楠, 李彤暉, 龍凱花, 辛永潔, 孫 力

（ 1.陜西省中醫(yī)藥研究院, 陜西 西安 710003； 2.陜西中醫(yī)學(xué)院, 陜西 咸陽(yáng) 712046； 3.鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)市中心醫(yī)院, 河南 洛陽(yáng) 471000）

鴉膽子油自微乳化顆粒在大鼠體內(nèi)生物利用度考察

李 曄1, 孫 雯2, 蔣 楠3, 李彤暉1, 龍凱花2, 辛永潔1, 孫 力1

（ 1.陜西省中醫(yī)藥研究院, 陜西 西安 710003； 2.陜西中醫(yī)學(xué)院, 陜西 咸陽(yáng) 712046； 3.鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)市中心醫(yī)院, 河南 洛陽(yáng) 471000）

目的 研究鴉膽子油自微乳化顆粒在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程及其相對(duì)生物利用度。方法 大鼠分別灌服市售鴉膽子油口服乳劑和鴉膽子油自微乳顆粒劑， 于不同時(shí)間點(diǎn)取血， HPLC法檢測(cè)血漿中鴉膽子油的油酸、 亞油酸，采用 DAS2.1.1 版軟件求算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。 結(jié)果 大鼠灌服市售鴉膽子油口服乳劑和鴉膽子油自微乳顆粒劑后油酸 AUT為 72.738、 170.334 （h·μg） /mL， 亞油酸為 41.393、 140.759 （h·μg） /mL。 制劑中油酸、 亞油酸相對(duì)生物利用度分別達(dá)到 234.2%、 340.1%。 結(jié)論 與市售鴉膽子油口服乳劑相比， 鴉膽子自微乳化顆?？擅黠@提高油酸、 亞油酸在大鼠體內(nèi)的相對(duì)生物利用度。

鴉膽子油;固體自微乳化給藥系統(tǒng);體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué);生物利用度

鴉膽子油的成分復(fù)雜， 其中 85%為甘油三酯， 其在體內(nèi)水解后可以轉(zhuǎn)化為具有抗癌活性的油酸［1］， 對(duì)多種腫瘤有良好的療效，可能的作用機(jī)制為:選擇性破壞腫瘤的細(xì)胞膜和線粒體; 抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和 DNA合成， 阻斷癌細(xì)胞的細(xì)胞周期;升白細(xì)胞作用;提高機(jī)體免疫力;對(duì)多種藥物的耐藥有逆轉(zhuǎn)作用。其中油酸、亞油酸被認(rèn)為是抗腫瘤的活性成分［2］。 鴉膽子油乳注射液為鴉膽子油經(jīng)乳化后制成的注射液， 在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療癌癥［1］。 對(duì)鴉膽子油自微乳化顆粒在機(jī)體內(nèi)的生物利用度進(jìn)行考察，并與市售鴉膽子油口服乳劑相比較，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及臨床應(yīng)用提供參考， 并為鴉膽子油 S-SMEDDS 的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)建立了 HPLC法測(cè)定鴉膽子油中油酸、亞油酸的量，測(cè)定了口服給藥的大鼠血漿藥物濃度，計(jì)算出鴉膽子油中油酸、亞油酸的相對(duì)生物利用度。

1 材料

1.1 儀器及試劑 高效液相色譜儀; 高效液相色譜儀（ LC-2010AHT型， 日 本島 津）;LC-Solution 色譜 數(shù) 據(jù) 工 作站; 電子天平 （型號(hào) BS210S， 0.1 mg， 北京賽多利斯天平廠）; 臺(tái) 式 離 心 機(jī) （ 型 號(hào) TGL-16G， 上 海 安 亭科 學(xué) 儀 器廠）; 超聲波清洗器 （ 型號(hào) KQ-100， 昆山市超聲儀器有限公司）; 電熱恒溫水浴鍋 （H.H.S 21-6K， 上海醫(yī)療器械五廠）; 移液槍 （型號(hào) 20 ～200 μL、 100 ～1 000 μL， 上海萬(wàn)島儀器科技有限公司）; 水浴箱、 冰箱、 吹風(fēng)機(jī)以及其他常用實(shí)驗(yàn)室儀器。

油酸 （Sigma公司， 純度≥99.0%， 批號(hào) BCBF5052）;亞油酸 （ Sigma公司， 純 度 ≥99.0%， 批 號(hào) BCBF2279 ）;冰醋酸， 三乙醇胺， ω-溴代苯乙酮， 丙酮， 甲醇為色譜純?cè)噭疄榧儍羲?，其他試劑均為分析純?/p>

1.2 試藥 鴉膽子油自微乳化顆粒劑 （實(shí)驗(yàn)室自制， 批號(hào)20120320）; 鴉膽子油口服乳液 （批號(hào) 20111208， 吉林省康福藥業(yè)有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字 Z22025409）。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠， SPF級(jí)， 雌雄各半， 體質(zhì)量 120 ～140 g， 由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 編號(hào)為0001381， 許可證號(hào) SCXK-（陜） 2007-001。

2 方法與結(jié)果

2.1 鴉膽子油自微乳顆粒的制備 稱取處方量聚氧乙烯氫化蓖麻油 （RH-40） 與聚乙二醇 400 （PEG400）， 辛酸癸酸三甘油酯 （GTCC） 與鴉膽子油， 分別混合均勻， （37 ± 1）℃磁力攪拌， 即得鴉膽子油自微乳， 靜置待用; 按處方稱取交聯(lián)聚維酮，待加入自微乳，自微乳完全被吸附后加入處方量的淀粉、 糊精， 混勻攪拌， 15%淀粉漿制粒。 濕顆粒在55 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h后整粒， 即得。

2.2 分組與給藥 取 SD大鼠 12 只， 正常飼養(yǎng)至體質(zhì)量約為 （270 ±20） g， 隨機(jī)分為 2 組， 顆粒劑組 （鴉膽子油自微乳化顆粒劑） 和對(duì)照組 （鴉膽子油口服乳劑）， 每組 6只。 采用灌胃給藥， 于大鼠禁食 12 h后， 從次日晨8 點(diǎn)開(kāi)始灌胃給藥， 分別于 0.17、 0.33、 0.50、 0.67、 0.83、 1、

2、 4、 6、 8 h 后頸總動(dòng)脈分離插管采血， 血樣置于肝素抗凝管中， 3 000 r/min 下離心 10 min， 取上層血清， -20 ℃冰箱冷藏備用。

2.3 血漿樣品處理方法［3]精密量取大鼠待測(cè)血漿樣品100 μL， 置于 10 mL具塞離心管中， 加 2.5 mL異丙醇-正庚烷-冰醋酸溶液 （4 ∶1 ∶0.25）， 渦旋 1 min， 間斷超聲2min， 室溫下放置 10min; 再精密加入正庚烷 1mL， 雙蒸水 1.5mL， 渦旋 1min， 間斷超聲 2 min， 3 000 r/min 離心10 min。 再精密吸取上清液 1 mL， 置于 5 mL具塞離心管中， N2吹干; 精密加入 20 μg/mL的 ω-溴代苯乙酮丙酮溶液、 25 μg/mL三乙醇胺丙酮溶液各 50 μL， 乙腈 300 μL，試管加塞密封， 混勻。 90 ℃水浴加熱 15 min， 冷卻至室溫; 精密加入 10 μg/mL醋酸溶液 75 μL， 90 ℃水浴加熱5min， N2吹 干; 精 密 加 入 甲 醇 500 μL， 超 聲 1 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾， 得到生物樣品衍生物溶液， 注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖。

2.4 生物樣品分析方法的建立

2.4.1 測(cè)定條件 油酸和亞油酸為血漿中的固有脂肪酸，實(shí)驗(yàn)前需采集未給藥大鼠基礎(chǔ)值 （即空白血樣）， 對(duì)此后的不同時(shí)間點(diǎn)的血樣進(jìn)行自身空白對(duì)照。

2.4.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) AgiLent ZORBAX E-cLipse XDB-C18色譜柱 （4.6mm×250mm， 5 μm） ; 流動(dòng)相為甲醇-水 （96 ∶4）; 柱溫 30 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng) 242 nm; 體積流量 1 mL/min; 進(jìn)樣量 10 μL。 見(jiàn)圖 1。

圖1 空白大鼠血漿、加入油酸、 亞油酸對(duì)照品的血漿和血漿樣品的 HPLC色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油酸、亞油酸在此色譜條件下分離良好，無(wú)其他雜質(zhì)干擾。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取大鼠空白血漿100 μL， 分別加入不同質(zhì)量濃度的油酸、亞油酸對(duì)照品溶液，使血漿中油酸、 亞油 酸 質(zhì) 量濃 度 分 別為 49.925、 34.960、 12.480、6.240、 3.120、 1.560、 0.370 μg/mL， 按 “2.2” 項(xiàng)血漿樣品處理方法處理，注入液相色譜儀。各質(zhì)量濃度油酸、亞油酸峰面積減去空白血漿油酸、 亞油酸峰面積 （Y） 對(duì)質(zhì)量濃度 （X） 做線性回歸， 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程: 油酸 Y= 4 736.8X-1 597.1， r=0.999 5; 亞油酸 Y=5 030X+ 2 087.6， r=0.999 5。 結(jié)果表明， 油酸、 亞油酸在進(jìn)樣質(zhì)量濃 度 分 別 在 1.560 ～49.925 μg/mL、 0.370 ～44.125 μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4 精密度 取大鼠空白血漿制備成高、 中、 低 3 個(gè)質(zhì)量濃度的血標(biāo)樣各 5 份 （油酸分別為 34.96、 12.48、 6.24 μg/mL; 亞油 酸分別為 26.925、 12.660、 6.280 μg/m L），按 “2.2” 項(xiàng)血漿樣品處理方法項(xiàng)下操作， 測(cè)定日內(nèi)和日間精密度，記錄峰面積，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各標(biāo)樣油酸、亞油酸的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，油酸、亞油酸日內(nèi)/日間精密度 RSD均 ＜7%， 該方法精密度良好， 符合生物樣品的分析要求。

2.4.5 相對(duì)回收率［4-5］取大 鼠空白血漿， 向 其中分 別加入不同質(zhì)量濃度油酸、亞油酸對(duì)照品溶液 （油酸分別為34.96、 12.48、 6.24 μg/m L; 亞 油 酸 分 別 為 26.925、12.660、 6.280 μg/mL）， 制備成高、 中、 低 3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿標(biāo)品樣品各 5 份， 并按 “2.2” 項(xiàng)下操作處理血標(biāo)樣，記錄峰面積，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算每份樣品中所得質(zhì)量濃度，并計(jì)算其與加入質(zhì)量濃度的比值即為相對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表 1。 結(jié)果表明， 該方法的相對(duì)回收率符合生物樣品的測(cè)定要求。

表1 生物樣品中油酸、亞油酸相對(duì)回收率

2.5 鴉膽子油自微乳顆粒大鼠生物利用度測(cè)定

2.5.1 相對(duì)生物利用度的測(cè)定 按照 “2.1” 項(xiàng)下， 制得生物樣品衍生物溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定血漿樣品中油酸、 亞油酸質(zhì)量濃度并比較， 見(jiàn)圖 2、 3。

圖2 不同制劑中油酸在體內(nèi)藥時(shí)曲線

圖3 不同制劑中亞油酸在體內(nèi)藥時(shí)曲線

結(jié)果表明，大鼠鴉膽子油自微乳化顆粒劑的血樣中，油酸、 亞油酸的 Cmax均為普通口服乳劑的 2 倍多， 曲線下面積 （AUC） 也遠(yuǎn)大于普通口服乳劑。2.5.2 藥-時(shí)曲線下面積和相對(duì)生物利用度的計(jì)算 根據(jù)不同血漿樣品中油酸、 亞油酸的血藥濃度-時(shí)間曲線， 使用DAS 2.1.1 版軟件， 對(duì)鴉膽子油口服乳劑和鴉膽子油自微乳化顆粒在血漿中的 AUC、 Cmax、 等參數(shù)進(jìn)行分析。 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

血漿中游離脂肪酸的定量測(cè)定報(bào)道較多［6-8］。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)際情況建立的 HPLC法簡(jiǎn)便、 快捷， 方法學(xué)各項(xiàng)參數(shù)均合格，可以滿足測(cè)定的要求。

實(shí)驗(yàn)室自制的鴉膽子油自微乳粒徑約 35 nm， 30 min溶出度可達(dá) 89.9%。 相對(duì)生物利用度結(jié)果證實(shí)， 鴉膽子油自微乳顆粒劑生物利用度明顯優(yōu)于市售口服乳劑，能夠顯著促進(jìn)鴉膽子油的口服吸收，其機(jī)理主要是在進(jìn)入胃腸道后，微乳乳滴能夠廣泛分布，與胃腸黏膜充分接觸，有利于鴉膽子油的吸收利用。同時(shí)，微乳中的脂質(zhì)能夠興奮脂蛋白的形成，促進(jìn)小腸淋巴循環(huán)，促進(jìn)鴉膽子油在小腸部位的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，降低首過(guò)效應(yīng)，提高鴉膽子油的生物利用度［9］。

SMEDDS 的藥時(shí)曲線存在雙峰現(xiàn)象， 這主要與藥物的釋放情況有關(guān)，微乳處方中較多的表面活性劑具有打開(kāi)細(xì)胞緊密連接、促進(jìn)藥物細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)，改變了藥物原有的胃腸道吸收行為，產(chǎn)生導(dǎo)致例如胃腸循環(huán)、雙吸收部位等特殊吸收［10］。 此外， 雙峰現(xiàn)象的產(chǎn)生也與微乳本身的理化性質(zhì) （如電位、 粒徑）、 生物學(xué)性質(zhì) （影響腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶系、細(xì)胞的緊密連接等）有密切的關(guān)系，需要進(jìn)一步研究［11］。

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R969.1

:B

1001-1528（2014）12-2615-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.040

2013-09-12

陜西省 “13115” 科技創(chuàng)新工程重大科技專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目 （2009ZDKG-82）

李 曄 （1970—）， 女， 博士生， 研究員， 研究方向: 中藥的新型給藥系統(tǒng)。 Tel: （029） 87251837， E-mail:liyelsj@163.com

日期:2014-05-12

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