李 曄, 孫 雯, 蔣 楠, 李彤暉, 龍凱花, 辛永潔, 孫 力

（ 1.陜西省中醫(yī)藥研究院, 陜西 西安 710003； 2.陜西中醫(yī)學院, 陜西 咸陽 712046； 3.鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院, 河南 洛陽 471000）

鴉膽子油自微乳化顆粒在大鼠體內生物利用度考察

李 曄1, 孫 雯2, 蔣 楠3, 李彤暉1, 龍凱花2, 辛永潔1, 孫 力1

（ 1.陜西省中醫(yī)藥研究院, 陜西 西安 710003； 2.陜西中醫(yī)學院, 陜西 咸陽 712046； 3.鄭州大學附屬洛陽市中心醫(yī)院, 河南 洛陽 471000）

目的 研究鴉膽子油自微乳化顆粒在大鼠體內的藥代動力學過程及其相對生物利用度。方法 大鼠分別灌服市售鴉膽子油口服乳劑和鴉膽子油自微乳顆粒劑， 于不同時間點取血， HPLC法檢測血漿中鴉膽子油的油酸、 亞油酸，采用 DAS2.1.1 版軟件求算藥動學參數。 結果 大鼠灌服市售鴉膽子油口服乳劑和鴉膽子油自微乳顆粒劑后油酸 AUT為 72.738、 170.334 （h·μg） /mL， 亞油酸為 41.393、 140.759 （h·μg） /mL。 制劑中油酸、 亞油酸相對生物利用度分別達到 234.2%、 340.1%。 結論 與市售鴉膽子油口服乳劑相比， 鴉膽子自微乳化顆?？擅黠@提高油酸、 亞油酸在大鼠體內的相對生物利用度。

鴉膽子油;固體自微乳化給藥系統(tǒng);體內藥代動力學;生物利用度

鴉膽子油的成分復雜， 其中 85%為甘油三酯， 其在體內水解后可以轉化為具有抗癌活性的油酸［1］， 對多種腫瘤有良好的療效，可能的作用機制為:選擇性破壞腫瘤的細胞膜和線粒體; 抑制癌細胞生長和 DNA合成， 阻斷癌細胞的細胞周期;升白細胞作用;提高機體免疫力;對多種藥物的耐藥有逆轉作用。其中油酸、亞油酸被認為是抗腫瘤的活性成分［2］。 鴉膽子油乳注射液為鴉膽子油經乳化后制成的注射液， 在臨床上被廣泛應用于治療癌癥［1］。 對鴉膽子油自微乳化顆粒在機體內的生物利用度進行考察，并與市售鴉膽子油口服乳劑相比較，為該制劑質量標準的制定及臨床應用提供參考， 并為鴉膽子油 S-SMEDDS 的進一步研究提供實驗基礎。 本實驗建立了 HPLC法測定鴉膽子油中油酸、亞油酸的量，測定了口服給藥的大鼠血漿藥物濃度，計算出鴉膽子油中油酸、亞油酸的相對生物利用度。

1 材料

1.1 儀器及試劑 高效液相色譜儀; 高效液相色譜儀（ LC-2010AHT型， 日 本島 津）;LC-Solution 色譜 數 據 工 作站; 電子天平 （型號 BS210S， 0.1 mg， 北京賽多利斯天平廠）; 臺 式 離 心 機 （ 型 號 TGL-16G， 上 海 安 亭科 學 儀 器廠）; 超聲波清洗器 （ 型號 KQ-100， 昆山市超聲儀器有限公司）; 電熱恒溫水浴鍋 （H.H.S 21-6K， 上海醫(yī)療器械五廠）; 移液槍 （型號 20 ～200 μL、 100 ～1 000 μL， 上海萬島儀器科技有限公司）; 水浴箱、 冰箱、 吹風機以及其他常用實驗室儀器。

油酸 （Sigma公司， 純度≥99.0%， 批號 BCBF5052）;亞油酸 （ Sigma公司， 純 度 ≥99.0%， 批 號 BCBF2279 ）;冰醋酸， 三乙醇胺， ω-溴代苯乙酮， 丙酮， 甲醇為色譜純試劑，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥 鴉膽子油自微乳化顆粒劑 （實驗室自制， 批號20120320）; 鴉膽子油口服乳液 （批號 20111208， 吉林省康福藥業(yè)有限公司， 國藥準字 Z22025409）。

1.3 動物 SD大鼠， SPF級， 雌雄各半， 體質量 120 ～140 g， 由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供， 編號為0001381， 許可證號 SCXK-（陜） 2007-001。

2 方法與結果

2.1 鴉膽子油自微乳顆粒的制備 稱取處方量聚氧乙烯氫化蓖麻油 （RH-40） 與聚乙二醇 400 （PEG400）， 辛酸癸酸三甘油酯 （GTCC） 與鴉膽子油， 分別混合均勻， （37 ± 1）℃磁力攪拌， 即得鴉膽子油自微乳， 靜置待用; 按處方稱取交聯(lián)聚維酮，待加入自微乳，自微乳完全被吸附后加入處方量的淀粉、 糊精， 混勻攪拌， 15%淀粉漿制粒。 濕顆粒在55 ℃烘箱內干燥3 h后整粒， 即得。

2.2 分組與給藥 取 SD大鼠 12 只， 正常飼養(yǎng)至體質量約為 （270 ±20） g， 隨機分為 2 組， 顆粒劑組 （鴉膽子油自微乳化顆粒劑） 和對照組 （鴉膽子油口服乳劑）， 每組 6只。 采用灌胃給藥， 于大鼠禁食 12 h后， 從次日晨8 點開始灌胃給藥， 分別于 0.17、 0.33、 0.50、 0.67、 0.83、 1、

2、 4、 6、 8 h 后頸總動脈分離插管采血， 血樣置于肝素抗凝管中， 3 000 r/min 下離心 10 min， 取上層血清， -20 ℃冰箱冷藏備用。

2.3 血漿樣品處理方法［3]精密量取大鼠待測血漿樣品100 μL， 置于 10 mL具塞離心管中， 加 2.5 mL異丙醇-正庚烷-冰醋酸溶液 （4 ∶1 ∶0.25）， 渦旋 1 min， 間斷超聲2min， 室溫下放置 10min; 再精密加入正庚烷 1mL， 雙蒸水 1.5mL， 渦旋 1min， 間斷超聲 2 min， 3 000 r/min 離心10 min。 再精密吸取上清液 1 mL， 置于 5 mL具塞離心管中， N2吹干; 精密加入 20 μg/mL的 ω-溴代苯乙酮丙酮溶液、 25 μg/mL三乙醇胺丙酮溶液各 50 μL， 乙腈 300 μL，試管加塞密封， 混勻。 90 ℃水浴加熱 15 min， 冷卻至室溫; 精密加入 10 μg/mL醋酸溶液 75 μL， 90 ℃水浴加熱5min， N2吹 干; 精 密 加 入 甲 醇 500 μL， 超 聲 1 min，0.45 μm濾膜過濾， 得到生物樣品衍生物溶液， 注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。

2.4 生物樣品分析方法的建立

2.4.1 測定條件 油酸和亞油酸為血漿中的固有脂肪酸，實驗前需采集未給藥大鼠基礎值 （即空白血樣）， 對此后的不同時間點的血樣進行自身空白對照。

2.4.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 AgiLent ZORBAX E-cLipse XDB-C18色譜柱 （4.6mm×250mm， 5 μm） ; 流動相為甲醇-水 （96 ∶4）; 柱溫 30 ℃; 檢測波長 242 nm; 體積流量 1 mL/min; 進樣量 10 μL。 見圖 1。

圖1 空白大鼠血漿、加入油酸、 亞油酸對照品的血漿和血漿樣品的 HPLC色譜圖

實驗結果表明，油酸、亞油酸在此色譜條件下分離良好，無其他雜質干擾。

2.4.3 標準曲線的制備 取大鼠空白血漿100 μL， 分別加入不同質量濃度的油酸、亞油酸對照品溶液，使血漿中油酸、 亞油 酸 質 量濃 度 分 別為 49.925、 34.960、 12.480、6.240、 3.120、 1.560、 0.370 μg/mL， 按 “2.2” 項血漿樣品處理方法處理，注入液相色譜儀。各質量濃度油酸、亞油酸峰面積減去空白血漿油酸、 亞油酸峰面積 （Y） 對質量濃度 （X） 做線性回歸， 得到標準曲線方程: 油酸 Y= 4 736.8X-1 597.1， r=0.999 5; 亞油酸 Y=5 030X+ 2 087.6， r=0.999 5。 結果表明， 油酸、 亞油酸在進樣質量濃 度 分 別 在 1.560 ～49.925 μg/mL、 0.370 ～44.125 μg/mL的范圍內呈良好的線性關系。

2.4.4 精密度 取大鼠空白血漿制備成高、 中、 低 3 個質量濃度的血標樣各 5 份 （油酸分別為 34.96、 12.48、 6.24 μg/mL; 亞油 酸分別為 26.925、 12.660、 6.280 μg/m L），按 “2.2” 項血漿樣品處理方法項下操作， 測定日內和日間精密度，記錄峰面積，根據隨行標準曲線方程計算各標樣油酸、亞油酸的質量濃度。結果表明，油酸、亞油酸日內/日間精密度 RSD均 ＜7%， 該方法精密度良好， 符合生物樣品的分析要求。

2.4.5 相對回收率［4-5］取大 鼠空白血漿， 向 其中分 別加入不同質量濃度油酸、亞油酸對照品溶液 （油酸分別為34.96、 12.48、 6.24 μg/m L; 亞 油 酸 分 別 為 26.925、12.660、 6.280 μg/mL）， 制備成高、 中、 低 3 個質量濃度的血漿標品樣品各 5 份， 并按 “2.2” 項下操作處理血標樣，記錄峰面積，根據隨行標準曲線方程，計算每份樣品中所得質量濃度，并計算其與加入質量濃度的比值即為相對回收率，結果見表 1。 結果表明， 該方法的相對回收率符合生物樣品的測定要求。

表1 生物樣品中油酸、亞油酸相對回收率

2.5 鴉膽子油自微乳顆粒大鼠生物利用度測定

2.5.1 相對生物利用度的測定 按照 “2.1” 項下， 制得生物樣品衍生物溶液，注入液相色譜儀，測定血漿樣品中油酸、 亞油酸質量濃度并比較， 見圖 2、 3。

圖2 不同制劑中油酸在體內藥時曲線

圖3 不同制劑中亞油酸在體內藥時曲線

結果表明，大鼠鴉膽子油自微乳化顆粒劑的血樣中，油酸、 亞油酸的 Cmax均為普通口服乳劑的 2 倍多， 曲線下面積 （AUC） 也遠大于普通口服乳劑。2.5.2 藥-時曲線下面積和相對生物利用度的計算 根據不同血漿樣品中油酸、 亞油酸的血藥濃度-時間曲線， 使用DAS 2.1.1 版軟件， 對鴉膽子油口服乳劑和鴉膽子油自微乳化顆粒在血漿中的 AUC、 Cmax、 等參數進行分析。 主要藥動學參數見表2。

表2 藥代動力學試驗統(tǒng)計結果

3 結論與討論

血漿中游離脂肪酸的定量測定報道較多［6-8］。 本實驗結合實際情況建立的 HPLC法簡便、 快捷， 方法學各項參數均合格，可以滿足測定的要求。

實驗室自制的鴉膽子油自微乳粒徑約 35 nm， 30 min溶出度可達 89.9%。 相對生物利用度結果證實， 鴉膽子油自微乳顆粒劑生物利用度明顯優(yōu)于市售口服乳劑，能夠顯著促進鴉膽子油的口服吸收，其機理主要是在進入胃腸道后，微乳乳滴能夠廣泛分布，與胃腸黏膜充分接觸，有利于鴉膽子油的吸收利用。同時，微乳中的脂質能夠興奮脂蛋白的形成，促進小腸淋巴循環(huán)，促進鴉膽子油在小腸部位的淋巴轉運，降低首過效應，提高鴉膽子油的生物利用度［9］。

SMEDDS 的藥時曲線存在雙峰現象， 這主要與藥物的釋放情況有關，微乳處方中較多的表面活性劑具有打開細胞緊密連接、促進藥物細胞間轉運的特點，改變了藥物原有的胃腸道吸收行為，產生導致例如胃腸循環(huán)、雙吸收部位等特殊吸收［10］。 此外， 雙峰現象的產生也與微乳本身的理化性質 （如電位、 粒徑）、 生物學性質 （影響腸道的轉運蛋白、酶系、細胞的緊密連接等）有密切的關系，需要進一步研究［11］。

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R969.1

:B

1001-1528（2014）12-2615-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.040

2013-09-12

陜西省 “13115” 科技創(chuàng)新工程重大科技專項項目 （2009ZDKG-82）

李 曄 （1970—）， 女， 博士生， 研究員， 研究方向: 中藥的新型給藥系統(tǒng)。 Tel: （029） 87251837， E-mail:liyelsj@163.com

日期:2014-05-12

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