何立巍, 吳曉培, 楊婧妍, 李 祥, 李 偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 南京 210023）

板藍(lán)根總生物堿的提取純化工藝及其抗病毒藥理作用研究

何立巍, 吳曉培, 楊婧妍, 李 祥*, 李 偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 南京 210023）

目的 優(yōu)選板藍(lán)根總生物堿有效部位提取純化工藝，并對純化后的總生物堿進(jìn)行抗病毒藥理作用研究。方法

中藥化學(xué);總生物堿;工藝條件;大孔樹脂吸附;抗病毒

板藍(lán) 根 為 十 字 花 科 植 物 菘 藍(lán) Isatis indigotica 的 干 燥根［1］。 主產(chǎn)于河北、 江蘇。 河南、 安徽、 陜西等地均有栽培。性寒，味苦，歸心、胃經(jīng)，清熱解毒，涼血利咽，用于外感發(fā)熱，溫病初起，咽喉腫痛，溫毒發(fā)斑，痄腮，丹毒， 癰腫瘡毒［2-3］。 板藍(lán)根生藥和現(xiàn)有制劑的療效研究表明其具有較好的抗病毒作用，此前研究表明板藍(lán)根總生物堿成分如 2，4 （1H， 3H） 喹唑二酮、 表告依春、 靛玉紅等體外具有抗病毒活性。本實驗對總生物堿有效部位提取工藝及其抗病毒藥理作用進(jìn)行深入研究，為板藍(lán)根新藥開發(fā)和藥材資源有效利用提供理論及實踐基礎(chǔ)。

1 儀器、 材料與試劑

板藍(lán)根藥材 （安徽省豐厚銅陵中藥飲片有限公司， 批號 20100823）; 利巴韋林顆粒 （四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司， 批號 20101102）， 板藍(lán)根顆粒 （蘭州佛慈制藥股份有限公司， 批號 20090813）。

E-201-C型 PH計 （ 上 海 精 密 科 學(xué) 儀 器 有限 公 司 ）;USC超 聲 波 清 洗 器 （ 上 海 波 龍 電 子 設(shè) 備 有 限 公 司）; FA1004 電子分析天平 （上海天平廠）; 凈化工作臺 （蘇州凈化設(shè)備廠）;CO2培養(yǎng)箱 （上海分析儀器廠）;24 孔微孔板 （美國 Corning公司）;D101 型大孔樹脂 （ 蚌埠市遼源新材料有限公司）; 乙醇氨水等試劑均為分析純; 水為超純水。 ICR小鼠 （南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 板藍(lán)根總生物堿提取工藝的優(yōu)化 平行稱取板藍(lán)根藥材 9 份， 每份 10 g， 利用 L9（34） 正交設(shè)計 （表 1）， 影響因素設(shè)定為乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量，提取時間，提取次數(shù)，測定各提取條件的干膏收率和總生物堿量?？偵飰A量測定采用電位滴定法， 取2 g干燥浸膏， 50 m L蒸餾水分散， 用固體氫氧化鈉調(diào) pH=12， 置分液漏斗中， 用三氯甲烷萃取 3 次 （每次 30 m L）， 合并三氯甲烷萃取液， 回收三氯甲烷至干， 殘渣用 10 mL乙醇溶解， 加入 0.01 mol/L硫酸 10 mL， 用 0.02 mol/L氫氧化鈉回滴至電位突躍， 示為終點， 計算總生物堿量 （以表告依春計， 每 0.01 mol/L硫酸液相當(dāng)于 2.583 6mg的表告依春）， 結(jié)果見表 2。

表1 提取工藝因素水平

表2 提取工藝正交試驗方案及結(jié)果

研究結(jié)果表明，干膏得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而降低，隨提取次數(shù)增加而升高。由于板藍(lán)根總生物堿與其藥效密切相關(guān)，故以生物堿量為主要評價指標(biāo)的優(yōu)選工藝條件為A3B1C3D2即乙醇體積分?jǐn)?shù) 80%， 提取時間 1 h， 溶媒量 12 倍，提取次數(shù) 2 次; 計算優(yōu)選是 A3B3C3D2即乙醇體積分?jǐn)?shù) 80%，提取時間2 h， 溶媒量12 倍， 提取次數(shù)2 次; 從結(jié)果分析提取時間對含有量影響并不大， 從節(jié)約成本考慮選擇工藝為 80%乙醇， 提取時間1 h， 溶媒量12 倍， 提取次數(shù)2 次。

2.2 大孔吸附樹脂富集純化工藝研究 大孔吸附樹脂的預(yù)處理和再生采用文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行。 取板藍(lán)根粗粉 100 g， 按照 “2.1” 項中優(yōu)選工藝條件進(jìn)行提取， 回收乙醇， 并配成表3中不同質(zhì)量濃度的上樣溶液。影響板藍(lán)根生物堿分離純化效果的因素主要有吸附 pH、 上樣質(zhì)量濃度、 洗脫液（乙醇） 體積分?jǐn)?shù)， 利用 L9（34） 進(jìn)行正交試驗設(shè)計， 以總生物堿的得率和含有量為指標(biāo)進(jìn)行工藝條件考察［5］， 因素水平見表3。經(jīng)處理好的大孔吸附樹脂裝柱， 以濃氨水調(diào)至所需的pH條件， 取樣品溶液上柱進(jìn)行吸附， 先用蒸餾水洗脫除去未吸附成分， 然后以堿性乙醇溶液 （溶液 pH和乙醇用量如表3所示） 洗脫約7倍柱體積，洗脫液合并干燥，測定總生物堿量并計算得率;總生物堿量測定方法同 “2.1” 項下。 結(jié)果見表 4。

表3 分離純化工藝因素水平

正交試驗結(jié)果表明，大孔樹脂分離純化最佳工藝條件為 A3B1C3， 生物堿的純度和得率都比較高。 方差分析結(jié)果表明，對于生物堿量影響主要因素排序依次為 C（乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)）、 A（pH） 和 B（樣品質(zhì)量濃度）; 對于由生物堿得率影響主要因素依次排序為 A（pH）、 C（乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)） 和 B（樣品質(zhì)量濃度）。 即在生物堿大孔樹脂分離純化工藝中， 控制吸附和洗脫的 pH條件以及洗脫溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)是至關(guān)重要的，而上樣時的樣品質(zhì)量濃度對于產(chǎn)品質(zhì)量影響較小。

表4 分離純化工藝正交試驗方案及結(jié)果

2.3 總生物堿測定方法學(xué)考察

2.3.1 加樣回收試驗 精密稱取已知總生物堿量的板藍(lán)根藥材 10 g， 共 6 份， 每份加入適量的表告依春對照品， 精密稱定。 按 “2.1” 項下優(yōu)選出的 A3B3C3D2工藝進(jìn)行樣品處理，并測定總生物堿量，計算回收率，得總生物堿的平均回收率為 97.62%， RSD為 2.8%， 見表 5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.2 重復(fù)性試驗 精密稱取板藍(lán)根藥材10 g， 共5 份， 按“2.1” 項下優(yōu)選出的 A3B3C3D2工藝進(jìn)行樣品處理， 并測定總生物堿量。 結(jié)果表明， 該方法重復(fù)性良好， RSD為 2.7%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試樣品溶液， 每隔 2 h 測定一次， 結(jié) 果 表 明， 該 樣 品 溶 液 在 12 h 內(nèi) 穩(wěn) 定， RSD為 2.4%。

2.4 板藍(lán)根總生物堿抗病毒藥理［2-3,6-13]作用研究

2.4.1 病毒培養(yǎng)及毒力測定 9 齡雞胚分別用 25%乙醇和2%碘酊消毒后， 于無菌條件下接種甲型流感病毒毒液 0.2 mL， 37 ℃條件下培養(yǎng) 48 h。 培養(yǎng)好的雞胚 4 ℃保存過夜，再次消毒后吸取尿囊液，相同方法重復(fù)培養(yǎng)2次后作為體內(nèi)實驗所用病毒尿囊液。病毒尿囊液體內(nèi)抗病毒實驗前需測定血凝滴度， 要求血凝滴度在 640 以上。

經(jīng)培傳代并經(jīng)血凝滴度測定的病毒尿囊液， 10體積連續(xù)稀釋為 7 個體積分?jǐn)?shù)， 作為 LD50測定試驗的 7 個劑量組（表 6）; 體質(zhì)量 18 ～20 g的 ICR小鼠 56 只， 隨機(jī)分為 7 個平行組; 每組小鼠分別滴不同體積分?jǐn)?shù) 50 μL的病毒稀釋液， 觀察 2 周內(nèi)小鼠死亡情況。 經(jīng) Reed Muench 法計算LD50=10-1.65， 實驗結(jié)果見表 6。

表 6 甲型流感病毒感染小鼠半數(shù)致死量 （LD50） 測定

2.4.2 板藍(lán)根總生物堿體內(nèi)抗甲型流感病毒作用 受試動物為 ICR小鼠 160 只， 隨機(jī)分為利巴韋林組、 板藍(lán)根顆粒組、 總生物堿組以及模型組， 每組 20 只， 經(jīng)鼻腔滴入 15倍 LD50的病毒溶液 20 μL進(jìn)行造模感染， 于造模當(dāng)天分別灌胃給不同受試藥物，模型組給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥7 d， 觀察并記錄兩周內(nèi)動物死亡情況。 動物給藥劑量和實驗結(jié)果見表7所示。

表7 板藍(lán)根總生物堿對甲型流感病毒感染小鼠的死亡保護(hù)作用

實驗結(jié)果表明， 板藍(lán)根總生物堿0.65 g/kg劑量組可明顯延長感染小鼠存活時間，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05）， 提示板藍(lán)根總生物堿具有一定的抗甲型流感病毒的作用。

3 討論

板藍(lán)根中生物堿多為吲哚類脂溶性生物堿，采用水提的方法并不能提出靛藍(lán)和靛玉紅等生物堿或者提出的含有量很少［14］， 所以選擇乙醇作為提取溶劑。 傳統(tǒng)分離純化生物堿時一般采酸堿溶劑法或離子交換樹脂法。此類方法因酸、堿或鹽類試劑用量較大，引入大量雜質(zhì)，會給后來的分離帶來不便;換用吸附樹脂則可避免此類問題，因吸附樹脂可用醇水溶劑進(jìn)行解吸和洗脫，回收溶劑后不會給產(chǎn)品中引入雜質(zhì)，且解吸容易，洗脫峰集中，是富集生物堿類物質(zhì)的較好方法。大量文獻(xiàn)報道證實，利用大孔吸附樹脂分離純化， 可得到純度較高的總生物堿產(chǎn)品［15-18］。

本實驗應(yīng)用溶劑法和大孔吸附樹脂法提取、分離純化板藍(lán)根生物堿，并優(yōu)選出最佳提取分離工藝，但總生物堿量仍然偏低。分析原因可能是:板藍(lán)根總生物堿在藥材中含有量較低;總生物堿量是以表告依春計算，表告依春分子質(zhì)量較小，而板藍(lán)根中另含有分子質(zhì)量較大的靛藍(lán)和靛玉紅等吲哚類生物堿。

藥理研究表明板藍(lán)根生物堿雖然具有一定抗流感病毒作用，但效果不如板藍(lán)根顆粒，提示板藍(lán)根中尚有其他類別的抗病毒活性成分，可能為多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。

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R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2611-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.039

2013-10-30

國家自然基金資助項目 （81473316）; 國家教育部博士點基金資助項目 （20093237120015）

何立巍 （1974—）， 男， 博士， 副教授， 從事中藥及天然藥物化學(xué)教學(xué)科研工作。 Tel: （025） 85811524， E-mail:he-lw@ 163.com

*通信作者: 李 祥， 女， 教授， 博士生導(dǎo)師。 Tel: （025） 51998182， E-mail:Lixiang-8182@163.com

應(yīng)用正交設(shè)計安排試驗因素，以得率和總生物堿量為指標(biāo)，比較不同工藝條件對板藍(lán)根總生物堿的提取純化效果;通過動物體內(nèi)抗病毒實驗，觀察板藍(lán)根總生物堿對甲型流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果 通過正交試驗優(yōu)選出板藍(lán)根生物堿最佳提取工藝為: 乙醇體積分?jǐn)?shù)為 80%， 提取時間為1 h， 溶媒量為 12 倍， 提取次數(shù)為2 次。 大孔吸附樹脂純化板藍(lán)根總生物堿最佳工藝條件為: 上樣液 pH為 10， 上樣液質(zhì)量濃度為 1 g/mL， 洗脫液 （乙醇） 體積分?jǐn)?shù) 80%。生物堿部位體內(nèi)抗病毒藥理結(jié)果表明， 板藍(lán)根生物堿 0.65 g/kg劑量組可延長甲型流感病毒感染小鼠存活天數(shù)和降低死亡率，表明總生物堿組具有一定的抗甲型流感病毒的作用。結(jié)論 大孔吸附樹脂對于板藍(lán)根生物堿具有一定的富集純化作用，板藍(lán)根總生物堿具有抗病毒活性。