易荊麗, 趙永恒, 周毅生, 王 嵩, 林麗微
(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006)
5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究
易荊麗, 趙永恒, 周毅生*, 王 嵩, 林麗微
(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006)
目的 研究 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的鎮(zhèn)痛抗炎作用。 方法 本實(shí)驗(yàn)采用熱板法和冰醋酸扭體法觀察鎮(zhèn)痛作用, 采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高法觀察抗炎作用。 結(jié)果 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮中、 高劑量組均能明顯延遲小鼠舔后足時(shí)間 (P<0.05), 并能減少冰醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng), 抑制率分別為 50.94%、 64.55%; 且該化合物中、 高劑量組對冰醋酸誘發(fā)小鼠腹腔毛血管通透性增高的抑制率分別為38.81%、 49.70%; 對二甲苯誘發(fā)的小鼠耳廓腫脹有明顯的抑制率分別為 45.00%、 65.27%。 結(jié)論 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮不具有物理及化學(xué)刺激具有鎮(zhèn)痛作用,對急性炎癥有明顯抑制作用。
5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮; 鎮(zhèn)痛; 抗炎
5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮是從豆科蘇木亞科羊蹄甲屬植物龍須藤 Bauhinia championii( Benth.) Benth.的干燥藤莖中提取分離出的化合物。龍須藤又稱為過崗圓龍、九龍?zhí)?、羊蹄藤、梅花入骨丹等,味甘、微苦,性溫,具有祛風(fēng)除濕、 行氣活血的功效[1], 主治風(fēng)濕痹痛, 中風(fēng)癱瘓,胃脘脹痛, 跌打損傷, 小兒疳積等癥[2]。 該藥在我國多個(gè)少數(shù)民族有悠久的用藥歷史[3]。 目前國內(nèi)外對龍須藤的研究主要集中在化學(xué)成分方面[4-7], 關(guān)于龍須藤的藥效研究鮮見報(bào)道,已有的藥效研究主要是用龍須藤的提取物來完成的[8-10]。 本課題旨在考察從龍須藤中分離得到的高 純度 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮在鎮(zhèn)痛抗炎方面的作用, 為龍須藤的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級昆明小鼠, 體質(zhì)量 18 ~22 g, 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供, 合格證號為 scxk (粵)2008-0020。 動物的 喂養(yǎng)條 件: 清 潔 通風(fēng)環(huán)境, 相 對濕度(50 ±5)%, 室溫 (23 ±1) ℃, 光照周期為 12 h。
1.2 藥品與試劑 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮 (按文獻(xiàn)所述方法[11]制備龍須藤乙酸乙酯浸膏, 將得到的浸膏進(jìn)行反復(fù)硅膠、凝膠柱層析,得到目標(biāo)化合物結(jié)晶并進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR、 IR鑒定), 純度 96%以上, 臨用時(shí)以10%丙二醇生理鹽水溶解。 羅通定片 (四川康福來藥業(yè)集團(tuán)有限公司, 批號 110501); 吲哚美辛 (臨汾奇林藥業(yè)有限公司, 批號 1307111); 生理鹽水 (東莞市普濟(jì)藥業(yè)有限公司, 批號 12022902); 伊文斯藍(lán) (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn), 批號 WC201109010), 冰醋酸、 二甲苯等試劑均為分析純。
1.3 儀器 UV-2450 紫外可見分光光度計(jì) ( 日本島津); AY120 電子天平 (日本島津); 打孔器;501 型超級恒溫水浴 (金壇市宏華儀器廠制造)。
2.1 鎮(zhèn)痛作用
2.1.1 小鼠熱板法致痛試驗(yàn) 取健康雌性小鼠于 (55 ± 0.5)℃熱板上, 選取不跳躍、 5 ~30 s內(nèi)舔后足的小鼠 50只, 隨機(jī)分為空白對照組 (10%丙二醇生理鹽水)、 陽性對照組 (劑量以羅通定計(jì)算, 0.04 g/kg)、 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、 中、 高 (劑量以 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮計(jì)算, 0.04、 0.08、 0.16 g/kg) 3 個(gè)劑量組共 5 組, 每組10 只。 重復(fù)2次測其正常痛閾值, 并以平均值作為該鼠給藥前痛閾值。 各組小鼠均灌胃給藥3 d, 每天1次, 給藥劑量 20 mL/kg, 末次給藥 30、 60、 90、 120 min 后分別測小鼠痛閾值。結(jié)果如表1所示,與空白對照組比較,中、高劑量組均能顯著抑制熱板刺激誘導(dǎo)的小鼠疼痛反應(yīng),且中劑量組持續(xù)時(shí)間長。表現(xiàn)為痛閾值升高,與空白對照組、給藥前比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。
2.1.2 對冰醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)的影響 取健康小鼠50 只, 雌雄各半, 分組情況及給藥方法同 “2.1.1” 項(xiàng)。于末次給藥 30 min 后, 每只小鼠均腹腔注射 0.6%冰醋酸(10 mL/kg)。 立即觀察并記錄注射冰醋酸 20 min 內(nèi)各組小鼠出現(xiàn)扭體 (腹部收縮內(nèi)凹、 伸展后肢、 臀部抬高、 蠕行) 的次數(shù), 并計(jì)算各藥抑制率[13]。 結(jié)果如表 2 所示, 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮中、 高劑量組對冰醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)均有明顯的抑制作用,與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05), 表明 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮對醋酸引起的疼痛有一定的鎮(zhèn)痛作用。
表 1 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對小鼠熱板法致痛的影響 (, n=10)
表 1 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對小鼠熱板法致痛的影響 (, n=10)
注:與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與給藥前痛閾值比較,△P<0.05,△△P<0.01
給藥后不同時(shí)間痛閾值/s 30min 60 min 90 min 120 min空白對照組 ——組別 劑量/(g·kg-1)給藥前痛閾值/ s 21.07 ±2.80 22.43 ±5.69 18.58 ±4.47 21.15 ±6.38 18.18 ±5.22低劑量組 0.04 22.32 ±2.87 22.80 ±4.76 24.33 ±5.03 21.50 ±5.53 16.38 ±3.88中劑量組 0.08 21.15 ±2.27 31.30 ±6.92 35.02 ±5.70**△ 34.70 ±5.13*△ 32.83 ±6.70*△高劑量組 0.16 22.88 ±2.31 31.95 ±6.39*△ 36.38 ±6.70**△△ 36.78 ±7.88**△△ 30.28 ±7.88羅通定組 0.04 20.15 ±2.37 36.42 ±7.11**△△ 32.13 ±5.50**△26.55 ±4.30 28.55 ±6.20
表 2 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對冰醋酸致小鼠疼痛的影響(,n=10)
表 2 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對冰醋酸致小鼠疼痛的影響(,n=10)
注:與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組 別 劑量 /( g·kg-1) 扭體次 數(shù) /次 抑 制率 /%空白對照組 —— 28.21 ±4.81——低劑量組 0.04 20.80 ±5.13 26.27中劑量組 0.08 13.84 ±3.29* 50.94高劑量組 0.16 10.00 ±3.17** 64.55羅通定組 0.04 8.13 ±2.1**71.18
2.2 抗炎作用
2.2.1 對二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響 取健康小鼠 50只,雌雄各半,隨機(jī)分為空白對照組(10%丙二醇生理鹽水) 、陽 性對照組 ( 劑 量 以 吲 哚 美 辛 計(jì) 算 ,0.007 5 g/kg) 、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮低、中、高( 劑量以 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮計(jì)算,分別為 0.04、0.08、0.16 g/kg)3 個(gè)劑 量組共 5 組,每組 10 只。 陽性藥物僅第 3 天給藥,其余各組均連續(xù)給藥 3 d,每 日 1 次, 末 次 給 藥 60 min 后, 在 小 鼠 右 耳 正 反面均勻涂抹二甲苯 20 μL/只致炎,左耳不涂作為正常耳,30 min 后 脫 頸椎處死 小 鼠,沿耳廓 基 線 剪 下 雙 耳 ,用 直 徑 9 mm的打孔器在左右耳相同位置打下圓耳片,稱量左右耳的質(zhì)量并計(jì)算其差值( 腫脹度) 及抑制率[14]。 結(jié)果 如表 3 所 示,5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮中、高劑量組及陽性對照組均能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹率,與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ,表明 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮可對抗二甲苯所致的急性炎癥反應(yīng),具有抗炎作用。
表 3 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(,n=10)
表 3 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(,n=10)
注: 與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組 別 劑量 /( g·kg-1) 腫脹 度 /mg 抑 制率 /%空白對照組 —— 9.30 ±2.60——低劑量組 0.04 7.53 ±2.46 19.00中劑量組 0.08 5.12 ±1.31* 45.00高劑量組 0.16 3.23 ±0.90* 65.27吲哚美辛組 0.007 5 2.30 ±0.80**75.27
2.2.2 小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的測定 取健康小鼠 50只, 雌雄各半, 分組情況及給藥方法同 “2.2.1” 項(xiàng), 于末次給藥 1 h 后, 尾靜脈注射 0.5%伊文斯藍(lán)生理鹽水溶液10mL/kg, 5min 后腹腔注射 0.6%冰醋酸生理鹽水溶液 10 mL/kg, 20 min 后脫頸椎處死小鼠, 剖腹, 用 6 m L生理鹽水分?jǐn)?shù)次沖洗腹腔, 收集沖洗液于10 mL離心管中, 離心,取上清液, 用 UV-2450 紫外可見分光光度計(jì)于波長 590 nm處測定吸光度[15]。 結(jié)果如表 4 所示, 與空白對照組比較,5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮中高劑量組能顯著降低冰醋酸所引起的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性升高 (P<0.05), 顯示了 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮具有較好的抗炎效果。
表 4 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 (, n=10)
表 4 5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 (, n=10)
注: 與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組 別 劑量 /( g·kg-1) A 抑制 率 /%空白對照組 —— 0.505 ±0.18——低劑量組 0.04 0.324 ±0.13* 35.91中劑量組 0.08 0.309 ±0.15* 38.81高劑量組 0.16 0.254 ±0.16** 49.70吲哚美辛組 0.0075 0.227 ±0.13**55.05
本實(shí)驗(yàn)采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法及冰醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增高兩種急性炎癥模型觀察了 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮對急性炎癥的實(shí)驗(yàn)性滲出、 腫脹的影響,并采用熱板法及冰醋酸扭體法觀察 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮對疼痛的抑制作用。
結(jié)果表明, 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮可抑制炎癥早期的水腫與滲出,同時(shí)對化學(xué)物質(zhì)引起的小鼠扭體反應(yīng)及熱板法致痛反應(yīng)也有較好的抑制作用。 本實(shí)驗(yàn)為開發(fā) 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮化合物的臨床應(yīng)用提供了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的急性或慢性結(jié)蹄組織炎癥,臨床以關(guān)節(jié)和肌肉游走性酸楚、疼痛為特征,屬變態(tài)反應(yīng)性疾病。炎癥因子在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用, 因此 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮的鎮(zhèn)痛抗炎的作用機(jī)制——能否抑制炎癥因子 (如前列腺素、 白三烯等)的產(chǎn)生,阻斷或抑制由它們所介導(dǎo)和激發(fā)的炎癥過程,是否為龍須藤藥材中治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要有效成分還有待進(jìn)一步研究。
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R285.5
:B
1001-1528(2014)12-2609-03
10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.038
2013-09-11
易荊麗 (1986—), 女, 碩士, 主要從事藥物新技術(shù)與新劑型研究。 Tel: (020) 39352168 , E-mail:yijingli2008@163.com
*通信作者: 周毅生 (1957 —) , 男, 教授, 碩士生導(dǎo)師, 從事藥物新劑型與新技術(shù)的研究。 Tel: (020 ) 39352168, E-mail:yishzhou @aliyun.com