周曉慧, 趙靜怡, 張樹峰, 徐 倩

（承德醫(yī)學院, 河北 承德 067000）

[科研報道]

丹皮酚通過抑制 NF-κB信 號 通 路下調(diào) MMP-9 的表達改善心梗后大鼠的心室重構(gòu)

周曉慧, 趙靜怡, 張樹峰, 徐 倩

（承德醫(yī)學院, 河北 承德 067000）

目的 探討丹皮酚對大鼠心肌梗死后， NF-κB、 MMP-9 表達的影響。 方法 將結(jié)扎左冠狀動脈前降支后 24 h 的Wistar大鼠隨機分為模型組、 丹皮酚［4、 6、 8 mg/（ kg·d） ］ 組、 卡托普利組及假手術(shù)組。 給藥 4 周后。 測量各組大鼠心 /體比， 采用 Western-blot法檢測各組 大鼠左室后壁心肌組織 NF-κB-P65、 MMP-9 的表 達。 結(jié)果 與假 手術(shù)組比較， 模型組心/體比明顯增加 （P＜0.05）， NF-κB-P65、 MMP-9 的表達顯著升高 （P＜0.01， P＜0.05）; 與模型組比較， 丹皮酚 ［4、 6、 8 mg/（kg·d）］ 組、 卡托普利組心/體比明顯降低 （P＜0.05）， NF-κB-P65、 MMP-9 的表達顯著降低 （P＜0.05）。 結(jié)論 心梗后心室重構(gòu)過程， NF-κB-P65、 MMP-9 的表達增加， 共同參與了心室重構(gòu)， 丹皮酚通過抑制 NF-κB-P65， 下調(diào) MMP-9， 逆轉(zhuǎn)心梗后的心室重構(gòu)。

心肌梗死; 心室重構(gòu); 丹皮酚;NF-κB;MMP-9

急性 心 肌梗死 （ acute myocardial infarction） 是導致慢性充血性心力衰竭的最主要病因之一，在急性心肌梗死后進展為心力衰竭的過程中，常常發(fā)生心室重構(gòu)，心室重構(gòu)是導致心力衰竭發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，心室重構(gòu)包括心肌實質(zhì)性重構(gòu)和心肌間質(zhì)重構(gòu)，心肌實質(zhì)重構(gòu)是指心室肥厚，心肌細胞病理性肥大、變性和壞死，心肌間質(zhì)重構(gòu)是指成纖維細胞的增生、 纖維化及細胞外基質(zhì) （ECM） 膠原網(wǎng)的量和組成的變化。以前認為心肌在重構(gòu)中扮演主要角色，目前則認為 ECM纖維膠原合成和降解之間動態(tài)平衡在心臟重構(gòu)過程中的作用十分重要。 ECM重縮是心肌梗死后心臟功能的決定因素［1］。 基質(zhì)金屬蛋白酶 （ MMPs） 是一組依賴于 Zn2+的蛋白酶家族， 是 ECM的水解蛋白， 其中 MMP9是 MMPs家族的主要成員之一。 大量的研究證實無論心梗的早期重構(gòu)， 還是晚期重構(gòu)， MMP2、 MMP9 都有持續(xù)的高水平的表達［2］。

研究表明，丹皮酚具有抗炎、抗氧化、抗血栓及抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理作用，本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)丹皮酚可通過抑制 TLR4 信號通路改善心室重構(gòu)［3］， 本研究旨在探討丹皮酚在抗心梗后心室重構(gòu)的過程中對基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMP） 活性的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物、 試劑和主要儀器 健康雄性 Wistar大鼠， 體質(zhì)量 （250 ±20） g， 購自北京阜康生物科技有限公司， 許可證號:SCXK （京） 2009-0004。 丹皮酚注射液， 寧波天真制藥有限公司 （10 mg/2 mL， 批號 0110603）， 卡托普利，江蘇平光制藥有限公司， 25 mg/片， 批號 120102。 兔抗大鼠 NF-κB p65 多克隆抗體; 小鼠抗大鼠 MMP-9 單克隆抗體購自 Santa Cruz公司; 辣根過氧化物酶標記山羊抗兔和兔抗小鼠 IgG購自北京中杉金僑生物技術(shù)有限公司; 增強化學發(fā)光 （ enhanced chem iluminescence， ECL） 試劑盒購自 Millipore公司; 其他試劑均為市售的分析純。 DW3000-B型小動物人工呼吸機， 淮北正華生物科技有限公司;ECG-11D心電圖機，惠州科美思醫(yī)用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性心肌梗死大鼠模型制作 參照文獻 ［4］ 方法，8% 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后， 仰臥位固定大鼠，經(jīng)氣管插管連接呼吸機，左胸縱切口，逐層分離，三、四肋間開胸，分離心包，暴露心臟，于左心耳下緣2 mm處使用無菌線完全結(jié)扎左冠狀動脈前降支，觀察大鼠心電圖ST段變化， 以 ST段持續(xù)抬高并出現(xiàn)室性心律失常， 判斷心肌梗死模型成功。假手術(shù)組僅在相應部位穿線，不結(jié)扎冠狀動脈。排除胸腔內(nèi)氣體，逐層關(guān)胸，自主呼吸恢復后拔出氣管插管， 縫合皮膚， 術(shù)后腹腔注射青霉素 20萬單位/d， 連續(xù) 3 d， 預防感染。

1.2.2 實驗分組和給藥方法 將術(shù)后存活的模型成功動物隨機分為模型組、 丹皮酚低劑量組 ［4 mg/（kg·d）， n= 10］、 丹皮酚中劑量組 ［6 mg/（kg·d）， n=10］、 丹皮酚高劑量組 ［8 mg/（ kg·d）， n=10］、 卡托普利組 ［10 mg/（kg·d）， n=10］， 另設(shè)假手術(shù)組 （n=8）。 術(shù)后第 2天開始給藥，每日1次，丹皮酚注射液腹腔注射，卡托普利灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組分別給予等量的生理鹽水代替丹皮酚注射液腹腔注射，等容積生理鹽水代替卡托普利灌胃。每周稱定質(zhì)量調(diào)整藥量1次，連續(xù)給藥4周。4周后各組存活動物數(shù)分別為模型組7只，丹皮酚低劑量組8只，丹皮酚中劑量組8只，丹皮酚高劑量組9只，卡托普利組8只， 假手術(shù)組 8只。

1.2.3 標本采集及處理 4 周后， 各組大鼠稱定體質(zhì)量，然后斷頸處死，開胸迅速取出心臟，稱心臟質(zhì)量，計算心質(zhì)量與體質(zhì)量的比值 （ 心 /體） 。 可以看到梗死區(qū)呈蒼白色，非梗死區(qū)呈深紅色，剪取左室后壁組織，一部 分 標 本 以 10% 甲 醛 固 定， 石 蠟 包 埋， 其 余 部 分-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 心肌組織 HE染色 取上述石蠟標本相應部位的連續(xù)切片各3張， 作HE染色， 觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 Western-blot測定 NF-κB、 MMP9 的表達 取左室后壁心肌組織，制備心肌組織勻漿，提取心肌組織總蛋白，采用 BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量， 取組織蛋白提取上清液進行 SD-PAGE凝膠電泳。 電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上， 加上 5%脫脂奶粉溶液封閉 4 ℃過夜， 依次加入鼠源 的 NF-κB、 MMP9 和 β-actin 抗 體， 4 ℃ 孵 育 過 夜 ，TBST洗滌 3 次， 10 min/次 ， 再 用 相 應 Ⅱ 抗 室 溫 孵 育 1 h，化學發(fā)光 ECL顯色劑顯色， X光膠片顯影、 定影， 蛋白條帶用 Quantity One凝膠 分 析 軟 件 進 行 半 定 量 分 析， 以 靶 蛋白條帶的吸光度值與 β-actin 蛋白條帶吸光度值的比值表示靶蛋白的水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心 /體比 模型組心 /體比較假手術(shù)組明顯升高， 丹皮酚處理組心/體比， 較模型組均有降低， 高劑量組較為明顯， 卡托普利組心/體比， 較模型組明顯降低。 見表1。

表 1 各組大鼠心/體比 （）

表 1 各組大鼠心/體比 （）

注: 與假手術(shù)組比較，*P＜0.05; 與模型組比較，#P＜0.05

組別 動物數(shù)/只心質(zhì)量/ mg體質(zhì)量/ g（心/體比）/（mg·g-1）8 756.28 ±12.56 256.45 ±13.39 2.95 ±0.049模型組 7 798.35 ±25.24 249.32 ±10.25 3.20 ±0.067*丹皮酚低劑量 8 780.63 ±22.52 255.65 ±9.45 3.05 ±0.089#丹皮酚中劑量 8 768.56 ±19.45 251.35 ±12.23 3.05 ±0.065#丹皮酚高劑量 9 760.79 ±15.56 258.23 ±11.57 2.94 ±0.043#卡托普利 8 762.38 ±20.34 254.67 ±9.98 2.99 ±0.053假手術(shù)組#

2.2 HE染色各組大鼠心肌結(jié)構(gòu)變化 假手術(shù)組肌絲完整，心肌細胞清晰可見，排列規(guī)則、細胞胞質(zhì)豐富、間隙均勻，模型組部分心肌纖維溶解斷裂、胞間組織松散，細胞核大量消失、固縮、碎裂，胞質(zhì)嗜酸性染色增強，心肌細胞明顯肥大，心肌組織壞死嚴重，表明急性心肌梗死模型建立成功，丹皮酚中、高劑量組心肌細胞排列及肌纖維溶解斷裂程度介于假手術(shù)組與模型組之間，表明丹皮酚對心室重構(gòu)有明顯抑制作用，丹皮酚高劑量組心肌受損的改善程度與卡托普利組相當， 整體形態(tài)較為清晰。 見圖1。

圖 1 HE染色各組大鼠心肌結(jié)構(gòu)變化 （ ×200）

2.3 Western-blot檢測 NF-κB-P65、 MMP9 的蛋 白表達 模型組 NF-κB-P65 的表達明顯高于假手術(shù)組 （ P＜0.01）， 丹皮酚低、 中、 高劑量組 NF-κB-P65 的表達顯著低于模型組（P＜0.05）， 卡托普利組 NF-κB-P65 的表達顯著低于模型組（P＜0.05） 見圖 2、 表 2; 模型組 MMP9 的表達明顯高于假手術(shù)組 （P＜0.05）， 丹皮酚中、 高劑量組 MMP9 的表達顯著低于模型組 （P＜0.05）， 卡托普利組 MMP9 的表達低于模型組 （P＜0.05） 見圖 3、 表 2。

圖 2 W estern-blot檢測各組大鼠心肌組織 NF-κBp65 的蛋白表達

圖 3 W estern-b lot檢測各組大鼠心 肌組織MM P-9 的蛋白表達

表 2 W estern-blot檢 測 各 組 大 鼠 心 肌 組 織 NF-κBp65、MMP-9 的蛋白表達 （， n=5）

表 2 W estern-blot檢 測 各 組 大 鼠 心 肌 組 織 NF-κBp65、MMP-9 的蛋白表達 （， n=5）

注: 與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01; 與模型組比較，#P＜0.05

組別 （ NF-κB/β-actin） （ MMP-9/β-actin）0.763 7 ±0.020 9 1.073 6 ±0.009 1模型組 1.177 9 ±0.042 4** 1.249 5 ±0.039 9*丹皮酚 低劑 量 1.086 6 ±0.027 4# 1.223 5 ±0.025 6丹皮酚 中劑 量 1.007 6 ±0.017 9# 1.150 7 ±0.029 3#丹皮酚 高劑 量 0.839 1 ±0.020 8# 1.094 9 ±0.044 4#卡托普 利 0.774 8 ±0.019 2# 1.112 1 ±0.036 7假手術(shù)組#

3 討論

急性心肌梗死后，心室發(fā)生進行性擴張和外形改變，稱為梗死后的 “心室重構(gòu)”， 是急性心肌梗死后發(fā)生慢性心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)。心室重構(gòu)包括心肌細胞的變化和細胞外基質(zhì)的變化，心肌細胞外基質(zhì)的纖維膠原蛋白合成和降解之間的動態(tài)失衡在心臟重構(gòu)過程中的作用十分重要，心梗后這種平衡被打破，引起心肌間質(zhì)纖維化，限制心肌活動，引起心室順應性降低和心肌收縮力下降，進一步可發(fā)展為心力衰竭。同時膠原沉積還可減慢除極波通過心肌的速度， 使心肌組織電穩(wěn)定性遭到破壞， 引起心律失常［5］。

MMP是一組 Zn2+依賴的內(nèi)切蛋白水解酶家族， 參與細胞外基質(zhì)的降解和膠原合成的調(diào)節(jié)［6］。 大量的研究證明，在心肌梗死的心室重構(gòu)期， MMP2、 MMP9 的表達及活性持續(xù)性的升高［7］。 目前認為 MMPs可能介入了心肌梗死后心室重縮過程的幾個方面， 包括早期 ECM的降解， 新合成的結(jié)締組織的重縮，炎細胞和纖維母細胞的遷移，血管的生成， 促進膠原沉積和纖維化［8］。 本實驗中， 各組大鼠實驗前體質(zhì)量無差異，4周后，模型組大鼠心質(zhì)量較假手術(shù)組增加， 其心/體比明顯升高， 表明心梗后有心室重構(gòu)的發(fā)生，心/體比增加可能與心肌細胞肥大、 纖維細胞增生、 膠原沉積及心肌細胞間質(zhì)纖維化相關(guān)。蛋白印跡雜交試驗進一步顯示， 模型組大鼠心肌細胞中 MMP9蛋白水平明顯的高于假手術(shù)組 （P＜0.05）， 本實驗結(jié)果與以往的實驗研究結(jié)果一致， 心梗后心室重構(gòu)的過程中 MMP9 的活性和表達持續(xù)升高。

本實驗結(jié)果還顯示丹皮酚低、中、高劑量處理組的大鼠心質(zhì)量和心/體比， 較模型組明顯降低; 大鼠心肌細胞的MMP9蛋白表達水平明顯的低于模型組， 提示丹皮酚可能通過抑制 MMP-9 的表達， 降低了 ECM 的降解， 減少了心肌正常膠原網(wǎng)絡(luò)的破壞，從而緩解心梗后室壁的變薄及左室擴張的趨勢，改善心梗后的心室重構(gòu)。

NF-κB是一種分布和作用十分廣泛的核轉(zhuǎn)錄因子， 它能夠與特異基因啟動子或增強子區(qū)域特定序列結(jié)合，啟動該基因的轉(zhuǎn)錄。 正常情況下， NF-κB與 IκB結(jié)合組成無活性的異源復合體存在于細胞質(zhì)中，在細胞外刺激信號的作用下， IκB發(fā)生磷酸化， 磷酸化的 IκB再被泛素化后在 26 S蛋白酶作用下， 釋放 NF-κB P50/P65 進入細胞核， 與靶基因上的 κB位點結(jié)合并導致該處 DNA發(fā)生構(gòu)象變化， 從而啟動或增強靶基因轉(zhuǎn)錄［9］。 通過對 MMP-9 基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)， MMP-9 基因啟動子序列-670—-599 為 NF-κB P65 的 結(jié)合位點， 當 κB P65 與 之 結(jié) 合 將 誘 導 MMP-9 基 因 轉(zhuǎn) 錄［10］。腫瘤細胞侵襲試驗發(fā)現(xiàn) NF-κB高度激活伴隨 MMP-9 的高表達，是細胞外基質(zhì)降解的主要調(diào)控機制。

炎癥的激活是引起心室重構(gòu)的主要因素， NF-κB是促炎癥基因表達的樞紐之一。心肌梗死期，局部缺血，氧供應不足，線粒體內(nèi)電子傳遞受阻，加之抗氧化酶活性降低，產(chǎn)生并積累大量活性氧 （ROS）， 較強的氧化應激狀態(tài)激活NF-κB， 進入細胞核， 調(diào)控促炎基因的表達， 如白細胞介素-1β （IL-1β）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）， IL-1β、 TNF-α一方面可以直接激活 MMPs系統(tǒng)， 特別是 MMP-9 和 MMP-2來降解心肌細胞外基質(zhì)的膠原纖維網(wǎng)，另一方面可以進一步促進 NF-κB的活化， 形成細胞因子激活的正反饋通路和惡性循環(huán)［11］。

本實驗結(jié)果顯示， 模型組大鼠心肌細胞 MMP-9 的水平升高與 NF-κB P65 呈正相關(guān)， 證明了在心室的膠原重縮中NF-κB參與了 MMP-9 的表達， 這一結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致。本實驗結(jié)果還顯示丹皮酚處理組與卡拖普利處理組大鼠心肌細胞 NF-κB P65 水平與 MMP-9 同步降低， 且具有統(tǒng)計學意義。課題組前期研究結(jié)果證明丹皮酚可抑制高脂血清誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞 NF-κB的活化。

綜上所述，心肌梗死后導致心力衰竭的心室重構(gòu)是一個多因素參與的復雜過程，其中包括神經(jīng)內(nèi)分泌的激活、氧化應激反應、慢性炎癥等，但殊途同歸，最終將通過激活 NF-κB調(diào)控 MMP-9 的表達， 從而參與心室重構(gòu)， 提示只要阻斷 NF-κB—MMP9 通路， 將能夠逆轉(zhuǎn)心肌梗死后的心室重構(gòu)。因而證實丹皮酚改善心梗后心室重構(gòu)作用可能是通過抑制 NF-κB通路下調(diào) MMP-9 的表達而實現(xiàn)的。

［1］ 房興銳， 黃 愷， 黃 丹， 等.1型多聚 ADP核糖聚合酶激活 NF-κB途徑調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶活性的機制研究［J］.臨床心血管病雜志， 2009， 25 （6）:472-475.

［ 2 ］ Mishra A， Srivastava A， Mittal T， etal.Association ofmatrix metalloproteinases（ MMP2， MMP7 and MMP9 ） genetic variants with left ventricular dysfunction in coronary artery disease patients［ J］ .Clin Chim Acta， 2012， 413 （19）:1668-1674.

［3］ 周曉慧， 任立群，劉維朝， 等.丹皮酚抑制心肌梗死家兔心肌 TLR4 信號通路改善心室重構(gòu)［J］.中國老年學雜志，2012， 32 （21）:4690-4692.

［ 4 ］ Palojoki E， Saraste A， Eriksson A， et al.Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats［ J］ .Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2001， 280 （ 6 ） : 2726-2731.

［ 5 ］ King M K， Coker M L， Goldberg A， et al.Selectivematrixmetalloproteinase inhibition with developing heart failure:effects on left ventricular function and structure［ J］ .Circ Res， 2003， 92（2）:177-185.

［ 6 ］ Wu D， Zhang H， Zhu Z J， et al.Study on tumor cell dissemination during orthotopic liver transplantation for hepatocellular carcinoma and its correlation with MMP-9 and CD44v6 ［ J］. Chin JModern Med， 2008， 18 （11） :1521-1524.

［ 7 ］ Francis G ， Spinale.Matrix metalloproteinases regulation and dysregulation in the failing heart［ J］ .CireRes， 2002， 90 （5）: 520-530.

［ 8 ］ Sakata Y， Yamamoto K， Mano T， et al.Activation of matrix metalloproteinases precedes left ventricular remodeling in hypertensive heart failure rats its inhibition as a primary effect of angiotensin-converting enzyme inhibitor［ J］.Circulation ， 2004，109 （17）:2143-2149.

［ 9 ］ Parodi F E， Mao D， Ennis T L.Suppression of experimental abdominal aortic aneurysms inmice by treatmentwith pyrrolidine dithiocarbamate， an antioxidant inhibitor of nuclear factor-kappaB［J］ .JVasc Surg， 2005， 41 （3） :479-489.

［10］ 朱佳蕾， 鄧夏珩， 高 麗， 等.白黎蘆醇通過核因子-κB信號通路抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶功能上調(diào)［J］.中國老年學雜志， 2013， 33 （5）:1073-1075.

［11］ 陳宇寧， 陳良龍.螺內(nèi)酯對大鼠冠狀動脈微血栓后心室重構(gòu)及心室功能的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志，2013， 15 （8）:862-865.

R285.5

:B

1001-1528（2014）12-2599-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.035

2014-02-13

河北省自然科學基金項目 （C2011406009）; 河北省衛(wèi)生廳項目 （20100137）

周曉慧 （1957—）， 女， 教授， 碩士生導師， 研究方向: 心血管藥理學。 E-mail:zxh5055@sina.com