周 濃, 張德偉, 郭冬琴, 丁 博, 張德全, 王 雪

（1.大理學(xué)院 藥學(xué)院, 云南 大理 671000； 2.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 重慶 404000； 3.重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所 中藥室, 重慶 404000）

菌根真菌對(duì)人工栽培滇重樓重金屬元素的影響

周 濃1,2, 張德偉3, 郭冬琴2, 丁 博2, 張德全1*, 王 雪1

（1.大理學(xué)院 藥學(xué)院, 云南 大理 671000； 2.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 重慶 404000； 3.重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所 中藥室, 重慶 404000）

目的 比較接種和不接種叢枝菌根真菌對(duì)滇重樓根莖中重金屬元素鉛、鎘、砷、銅、汞的影響。方法 通過(guò)室溫盆栽接種試驗(yàn)方法， 采用微波消解-原子吸收光譜法測(cè)定并比較收獲滇重樓根莖中重金屬的差異。 結(jié)果 不同叢枝菌根真菌對(duì)滇重樓根莖中重金屬量的影響存在差異。接種叢枝菌根真菌能部分地降低其根莖中重金屬含有量，所測(cè)量值均低于 《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （WM2-2001）》 和 《中國(guó)藥典》 2010 年版相應(yīng)的重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論 人工接種叢枝菌根真菌可保證滇重樓臨床用藥的安全性。

滇重樓; 叢枝菌根真菌; 微波消解-原子吸收光譜法; 重金屬

滇 重樓為百合 科 重 樓屬植物云南重樓 Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（ Franch.） Hara的干燥根莖， 現(xiàn)已列為二級(jí)瀕危藥用植物［1］。 由于滇重樓生長(zhǎng)條件獨(dú)特、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，加上產(chǎn)區(qū)藥農(nóng)過(guò)度采挖， 導(dǎo)致滇重樓野生資源瀕臨滅絕［2］。 滇重樓人工栽培已成為解決市場(chǎng)需求，實(shí)現(xiàn)野生資源可持續(xù)利用的唯一途徑［3］。 滇重樓具有典型的重樓型叢枝菌根 （ AM），顯示出較強(qiáng)依賴(lài)性［4］。 前期研究表明，采用AM真菌誘導(dǎo)子預(yù)處理后，沒(méi)有改變滇重樓根莖的化學(xué)背景，但能部分提高其根莖中化 學(xué) 成 分 的 量［5］。 叢 枝 菌 根 真 菌 （ arbuscular mycorrhizal fungi，AMF） 侵染藥用植物根系形成共生體過(guò)程中，通過(guò)參與藥用植物生理生化代謝過(guò)程與基因調(diào)控，既能促進(jìn)藥用植物生長(zhǎng)與發(fā)育，又能改善其根際微生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)宿主植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素 （ 重金屬） 的吸收［6-9］。有 資料表 明， 當(dāng) 土壤溶液中重金屬元素濃度較低的情況下，叢枝菌根真菌侵染能有效地促進(jìn)根系對(duì)重金屬元素的吸收，同時(shí)不同種類(lèi)的中藥材對(duì)不同重金屬元素表現(xiàn)出吸附特異性［9-12］。隨著我國(guó)對(duì)中藥的認(rèn)識(shí)不斷發(fā)展， 重金屬是目前公認(rèn)的對(duì)人體有害微量元素，重金屬殘留和污染嚴(yán)重影響了中藥的內(nèi)在質(zhì)量，其問(wèn)題已對(duì)中藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā) 展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［13］。 為此，本實(shí)驗(yàn)采用原子吸收光譜法對(duì)不同AMF處理滇重樓中重金屬元素進(jìn)行分析，從重金屬角度評(píng)估采用AMF提高滇重樓人工栽培品的質(zhì)量安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

叢枝菌根真菌來(lái)自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所國(guó)家基金資助 “叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù) （ BGC）”: 根 內(nèi)球囊 霉 Clomus intraradices（ 編號(hào) BGCAH01）、 聚叢球囊霉 Clomus aggregatum（ 編號(hào) BGC HK02D）、 象牙白球囊霉 Clomus eburneum （編號(hào) BGC HK02C）、 摩西球囊霉 Clomusmosseae（編號(hào) BGC YN05）、 地表球囊霉 Clomus Versiforme（ 編號(hào) BGCGD01C） 、幼套球囊霉 Clomusetunicatum （ 編號(hào) BGC GZ03C）、扭形球 囊霉 Clomus tortuosum （ 編 號(hào) BGC NM03A）、 沾屑多樣 孢 囊霉Diversispora spurcum （編號(hào) BGC SD03A）， 以上菌劑為沙土混合物，內(nèi)含供試菌種孢子、侵染根段和菌絲片段;“根友”牌阿密蔻菌根由上海弘升科技發(fā)展有限公司惠贈(zèng);以不接種叢枝菌根真菌組為空白組 （CK組）; 滇重樓根莖取自大理市花甸壩藥材場(chǎng)的同一批樣品，并由大理學(xué)院藥學(xué)院周濃副教授鑒定 為百合科 植 物 云南重樓 Paris polyphylla var. yunnanensis的根莖。 供試土壤購(gòu)自大理市花鳥(niǎo)市場(chǎng)的林下腐殖土與當(dāng)?shù)厣叭劳涟凑?∶1比例混合，風(fēng)干過(guò)篩， 在 121 ℃高壓濕熱滅菌 2 h。 2010 年 2月14日采用室溫盆栽方法， 生長(zhǎng)期間按常規(guī)管理，定期澆水、 護(hù)理。 2010 年 12 月 12 日收獲滇重樓植株的根莖， 清洗， 45 ℃烘干， 按分析要求分別粉碎過(guò)篩 （40 目）， 備用。

鉛、鎘、銅、汞、砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心， 質(zhì)量濃度均為 1 mg/mL; 實(shí)驗(yàn)用水為超純水;試劑均為優(yōu)級(jí)純。

ML204 型分析天平 （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;Multiwave 3000 型微波消解儀 （ 奧地利安東帕中國(guó)有限公司）;AA-6300C型原子吸收分光光度計(jì) （島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司）; 鉛、鎘、銅空心陰極燈，汞、 砷無(wú)極放電燈 （珀金埃爾默儀器上海有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件 采用石墨爐原子吸收法測(cè)定 Pb、Cd、 As，采用火焰原子吸收法測(cè)定 Cu， 采用氫化物-冷原子吸收法測(cè)定 Hg［14］。測(cè)定波長(zhǎng): 鉛 283.3 nm， 鎘 228.8 nm， 砷 193.7 nm， 銅 324.7 nm， 汞253.7 nm。 狹縫: 鉛、 銅、 汞均為 0.5 nm， 鎘 0.6 nm， 砷0.7 nm。測(cè)量模式: 峰面積法。

2.2 樣品溶液的制備 樣品的前處理和轉(zhuǎn)移參照文獻(xiàn) ［15］， 分別精密稱(chēng)取樣品 0.5 g， 置四氟乙烯微波消解罐中，加硝酸5 m L混勻。 置微波消解爐內(nèi)進(jìn)行消解 （第 1 步室溫 經(jīng) 3 min 升至溫度100 ℃， 保持 2 min， 第 2 步 100 ℃經(jīng) 5min 升至溫度 180 ℃， 保持 15 min）。 消解完畢后冷卻至室溫，取出內(nèi)罐將消解液轉(zhuǎn)移并定容到10 mL量瓶中， 搖勻，即得供試品溶液。同法隨行制備空白對(duì)照溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別精密量吸取 Pb、 Cd、As、 Cu 和 Hg的對(duì)照品貯備液按 《中國(guó)藥典》 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)［16］。按 “2.1” 項(xiàng)下測(cè)定條件測(cè)定吸收度， 以吸收度 （A） 為縱坐標(biāo)、 質(zhì)量濃度 （C） 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg的回歸方程分別為:A=0.006 040C+0.038 300 （r=0.997 7）; A=0.070 195C+0.027 730 （r=0.996 9）;A= 0.011 926C+0.058 910（r=0.999 3）;A=0.179 060C+ 0.001 406（r=0.999 0）;A=0.007 363C+0.003 020（r=0.999 9）。 線(xiàn) 性范圍 分別為 0 ～100 μg/m L、0 ～10 μg/mL、0 ～40 μg/mL、 0 ～80 μg/mL、0 ～40 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn) 取上述 Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg同一標(biāo)準(zhǔn)溶液 （10 μg/mL）， 按 “2.1” 項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得各元素的吸收度，RSD分別為 1.7%、 0.3%、 1.4%、 1.0%、 2.1%。表明儀器的精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一滇重樓樣品 6 份 （CK組）， 按 “2.2” 項(xiàng)下方法制備樣品溶液及 “2.1”項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得各元素的吸收度，Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg的 RSD 分 別 為 1.1%、2.7%、 2.6%、 2.3%、 3.0%。 表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一滇重樓樣品溶液 （CK組）， 室溫密閉放置， 按 “2.1” 項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定， 在0 ～24 h 內(nèi)每隔 4 h 測(cè)定 1 次， 測(cè)得各元 素 的 吸 收 度， RSD 分 別 為 1.1%、 1.3%、0.3%、1.0%、 0.9%。 表明樣品溶液在室溫下放置24 h各元素的量基本不變。

2.7 檢出限試驗(yàn) 在 “2.1” 項(xiàng)下測(cè)定條件對(duì)同法同時(shí)制備試劑的空白溶液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定11次， 其檢測(cè)結(jié)果的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率作為本方法各元素的檢出限。 Pb、 Cd、 As、 Cu、 Hg的檢出限分 別 為 0.023 6、 0.001 1、 0.052 8、 0.009 4、 0.025 2 mg/kg， 結(jié)果符合痕量測(cè)定的要求。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一滇重樓樣品0.25 g（CK組），共 6 份，分別精密加入 Pb、 Cd、As、 Cu、 Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液適量， 按 “2.2” 項(xiàng)下方法制備樣品溶液及 “2.1” 項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定各元素的吸收度，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，本方法回收率良好，符合分析要求， 結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）Tab.1 Results of the recovery tests（n=6）

2.9 樣品測(cè)定 按 “2.2” 項(xiàng)下方法制備樣品溶液及 “2.1”項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 接種叢枝菌根真菌對(duì)滇重樓根莖重金屬的影響 （mg/kg）Tab.2 Effect of AM fungi inoculated on contents of heavy metals in rhizome of P.polyphylla var.Yunnanensis（ mg/kg）

藥材安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)對(duì)外貿(mào)易綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （ WM2-2001）》 中藥材重金屬含量限值規(guī) 定［17］: 重 金 屬 總 量 ≤ 20.0 mg/kg， As≤ 2.0 mg/kg， Hg≤0.2 mg/kg， Cd ≤0.3 mg/kg， Pb ≤5.0 mg/kg， Cu≤20.0 mg/kg。 結(jié)果表明， 不同接種叢枝菌根真菌人工栽培后，重金屬殘留程度不同，但均未超過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)的限量值，藥材是安全的。

由表2可知，重金屬殘留量在不同叢枝菌根真菌處理組與CK組之間差別并不明顯，部分叢枝菌根真菌處理組中重金屬元素殘留量超過(guò)CK組，可能與其滇重樓遺傳差異性、吸附能力大小以及叢枝菌根真菌對(duì)同一種重金屬的吸附特性等［11-12，18-19］有關(guān)，是否具有一定的富集能力，有待采集更多樣本進(jìn)一步研究其代謝規(guī)律，以達(dá)到增效減毒的目的。

中藥材的重金屬污染，常具有一定的隱蔽性，土壤中的重金屬經(jīng)藥用植物吸收后通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體， 進(jìn)而危害人體健康［20］。 目前對(duì)接種叢枝菌根真菌處理藥用植物的研究多為生長(zhǎng)發(fā)育及其無(wú)機(jī)元素吸收等方面，尤其是與藥用植物產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的研究，而對(duì)接種叢枝菌根真菌處理后根莖等地下部分重金屬含有量的關(guān)注較少。研究接種叢枝菌根真菌處理后地下部分重金屬污染特征，可為叢枝菌根真菌提高栽培藥用植物產(chǎn)量及質(zhì)量、穩(wěn)定藥效與藥源提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

采用微波消解-原子吸收光譜法控制滇重樓人工栽培品中 Pb、 Cd、As、 Cu、 Hg等重金屬的量，保證了藥材使用的安全性。結(jié)果表明，接種叢枝菌根真菌后的滇重樓中重金屬殘留量有差異，但均遠(yuǎn)低于國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中重金屬的允許量。從重金屬污染這個(gè)角度來(lái)說(shuō)，采用叢枝菌根真菌處理的滇重樓及其衍生產(chǎn)品是安全的，為滇重樓人工栽培方法的選擇提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Effect of the arbuscular mycorrhiza fungi on heavy metals in Paris polyphylla var.yunnanensis by artificial cultivation

ZHOU Nong1，2， ZHANG De-wei3， GUO Dong-qin2， DING Bo2， ZHANG De-quan1*， WANG Xue1

AIM To compare effect of the arbuscular mycorrhiza（ AM） fungus inoculation and non-inoculation on contents of heavymetals Pb， Cd， As， Cu and Hg in rhizome of Parispolyphylla var.yunnanensis.METHODS By pot experiment at room temperature， contents of heavy metals in rhizome of P.polyphylla var.yunnanensis were determined and compared using the atomic absorption spectrometry after microwave digestion.RESULTS There was difference among various AM fungi on contents of heavy metals in the rhizome.Inoculated treatment of AM fungi could partly reduce contents of heavymetals in rhizome of P.polyphylla var.yunnanensis，and themeasured valueswere lower than the corresponding limit standards in the Creen Trade Standards of Importing&Exporting Medicinal Plants&Preparations（ WM2-2001） and the Chinese Pharmacopoeia （2010 version）. CONCLUSION AM fungi by artificial inoculation could ensure the safety ofmedication of P.polyphylla var. yunnanensis clinically.

Paris polyphylla var.yunnanensis;arbuscularmycorrhiza（AM） fungus;atomic absorption spectrometry aftermicrowave digestion;heavy metal

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2583-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.031

2013-11-27

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助 （2011FB081）; 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81260622）; 云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2012Z119）

周 濃 （1978—）， 男， 碩士， 副教授， 研究方 向: 藥 用植物 栽培 與質(zhì)量 控制。 Tel: （023） 58102522， E-mail:erhaizn@ 126.com

*通信作者: 張德全 （1980 —） ， 男， 博士， 講師， 研究方向: 藥用植物學(xué)。 Tel: （0872） 2257411， E-mail:zhangdeq2008@126.com

（1.College of Pharmacy， Dali University， Dali 671000， China;2.College of Life Science and Engineering， Chongqing Three Corges University，Chongqing 404000， China;3.Chongqing Wanzhou Institute for Food and Drug Control， Chongqing 40400， China）