張俊鵬, 張寶嬋, 李瑞明, 林 穎, 劉 怡, 林銀奎, 陳小陸

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 廣東 廣州 510080）

HPLC法檢測不同地區(qū)野生槐花花蕾中蘆丁與槲皮素

張俊鵬, 張寶嬋, 李瑞明*, 林 穎, 劉 怡, 林銀奎, 陳小陸

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 廣東 廣州 510080）

目的 建立 HPLC法測定不同產(chǎn)地的野生槐花花蕾中蘆丁與槲皮素的量。 方法 采用堿水提取法提取槐花花蕾中的蘆丁和槲皮素。 采用 Agilient HC-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 色譜柱， 以甲醇-0.4%磷酸水溶液 （52 ∶48 ） 為流動相， 體積流量為 0.9 mL/min; 檢測波長為 360 nm; 柱溫為 25 ℃。 結(jié)果 蘆丁在 2.5 ～80 μg/mL范圍內(nèi)， 槲皮素在 0.625 ～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好; 平均回收率分別為 100.2%和 99.1%;RSD分別為 2.1%和 1.1% （n= 6）。 來自 10 個產(chǎn)地的槐花花蕾中蘆丁的量在 21.48% ～28.21%之間， 槲皮素的量在 1.15% ～1.74%之間。 結(jié)論 不同產(chǎn)地槐花花蕾中蘆丁和槲皮素存在一定差異，其中以河南新鄭的槐花花蕾中蘆丁與槲皮素含有量最高。

槐花花蕾;蘆丁;槲皮素

黃酮類作為一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，具有良好的抗氧化活性， 早在 19 世紀(jì) 50 年代，就引起了食品和藥品行業(yè)的廣泛關(guān)注［1］。 黃酮類具有廣泛的功效，可有效地清除體內(nèi)的氧自由基，防止氧自由基損傷細(xì)胞膜和 DNA， 這種抗氧化作用可用于預(yù)防細(xì)胞的衰老與退化，并有利于預(yù)防癌癥的發(fā)生［2］。

槐花花蕾為我國傳統(tǒng)中藥材，在各地均有分布，主產(chǎn)于河南、山東、山西、陜西、安徽、河北、江蘇等地。藥理研究和臨床試驗表明，槐花花蕾具有抗腫瘤、 抗癌［3］、 抗生育［4］和止血活性［5］，其主要活性成分為黃酮類化合物。槐花花蕾中富含黃酮類成分，如蘆丁、槲皮素、山柰酚等。蘆?。╮utin） 是一種無毒的生物類黃酮， 目前已在 70 多種植物中發(fā)現(xiàn)［6］。 蘆丁有抗炎、 維生素 P樣作用和抑制醛糖還原酶的作用，它在人體內(nèi)的毒性很低，在臨床上用于治療腋窩淋巴結(jié)切除后的淋巴水腫［7］等疾 病。槲 皮素同樣具 有 廣泛的生物 活 性，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞浸潤和血管新生［8］等， 同時作為一種抗氧化劑， 它也可以保護正常細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和突變［9］。 目前，市場上已有蘆丁的相關(guān)制劑，如復(fù)方蘆丁片和復(fù)方三嗪蘆丁片，分別用于治療毛細(xì)血管出血癥和高血壓?。?0］。

槐花花蕾為提取蘆丁和槲皮素的一種重要原料，而我國野生槐花花蕾資源豐富，且大量出口，如何對野生槐花花蕾的質(zhì)量進行控制，提高其有效利用率顯得尤為重要。因此，本研究對不同產(chǎn)地野生槐花花蕾中蘆丁和槲皮素的量進行研究，為槐花花蕾的質(zhì)量控制提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1200 型高效液相色譜儀 （Agilent）; 磷酸、 鹽酸、氫氧化鈣等購自廣州化學(xué)試劑廠，均為分析純; 蒸餾水 （屈臣氏）; 色譜甲醇 （Merck）。 蘆丁（中 國 食 品 藥 品 檢 定 研 究 院， 批 號 100080-201207）、 槲皮素 （中國食品藥品檢定研究院，批號 100081-201206）。 槐花花蕾采自河南新鄭、 河南許昌、山東泰安、山東濟南、山西運城、廣西全州、安徽亳州、江蘇無錫、河北石家莊、北京。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取 30 g槐花花蕾粉末， 加0.4%硼砂沸水 200 mL， 攪拌下加入適量飽和石灰水溶液調(diào) pH 8 ～9， 加熱保持微沸， 并不斷攪拌， 煮沸 15 min 后趁熱抽濾， 濾渣重復(fù)提取 2次，抽濾。合并 3次濾液，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 3 ～4。 放置 2 h， 使沉淀完全， 抽濾， 得樣品。將樣品干燥后稱定質(zhì)量，精密稱取適量樣品置于10 m L量瓶中， 加適量甲醇定容， 搖勻， 即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取在120 ℃干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁和槲皮素對照品5.02 mg、 5.05 mg， 分別置于 50 mL量瓶中， 加適量甲醇溶解，定容至刻度，搖勻。

2.2 色 譜 條 件 色 譜 柱 Agilient HC-C18（ 4.6 mm×250 mm， 5 μm）; 流動相 A為甲醇， 流動相B為 0.4%的磷酸 （A） -水溶液 （B） （52 ∶48），體積流量 0.9 m L/min; 檢 測 波 長 360 nm; 柱 溫25 ℃; 進樣量 10 μL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取對照品溶液適量，分別置于量瓶中，加入適量甲醇，定容至刻度，得到蘆丁的質(zhì)量濃度分別為 2.5、 5.0、 10.0、 20.0、40.0、80.0 μg/mL， 槲 皮 素 的質(zhì) 量 濃 度 分 別 為0.625、 1.25、2.5、5.0、 10.0、 20.0 μg/mL，過濾后按照上述色譜條件進樣。分析結(jié)果表明，蘆丁在 2.5 ～80.0 μg/m L、 槲 皮 素 在 0.625 ～20.0 μg/mL范圍內(nèi)和峰面積線性關(guān)系良好。 蘆丁的線性回歸方程為 Y=0.026 7X+0.302， r=0.999; 槲皮素的線性回歸方程為 Y=0.013 1X+0.372 8， r= 0.999 2。

2.4 精密度試驗 取 “2.1.2” 項下蘆丁和槲皮素對照品溶液，按上述色譜條件進樣6次，結(jié)果蘆丁和槲皮素的峰面積 RSD分別為 0.3%和 0.4%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 精密稱取河南新鄭產(chǎn)槐花花蕾30 g， 共 6 份，按 “2.1.1”項下制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定。 6 份樣品測定結(jié)果 RSD為 0.8%， 表明重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取 “2.1.1”項下樣品溶液，室溫放置 0、 1、2、 4、 8、16、 24、 48 h 后分別測定， 蘆丁和槲皮素峰面積的 RSD分別為 1.0%和1.6%， 表明樣品溶液在 48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取 6 份已知含有量的河南新鄭槐花花蕾樣品各 1.0 mg， 分別精密加入一定量的蘆丁和槲皮素對照品溶液，按“2.1.1” 項制備成供試品溶液， 按上述色譜條件測定， 計算， 蘆丁的平均加樣回收率為 100.2%，RSD為 2.1%; 槲 皮 素 的 平 均 加 樣 回 收 率 為99.1%， RSD為1.1%。 具體見表 1， 表 2。

2.8 樣品的測定 分別取各個產(chǎn)地的樣品溶液，按上述色譜條件測定，計算蘆丁和槲皮素的量，結(jié)果見表3和圖1。

表1 蘆丁的加樣回收率Tab.1 Results of recovery tests for rutin

表2 槲皮素的加樣回收率Tab.2 Results of recovery tests for quercetin

表 3 蘆丁和槲皮素測定結(jié)果 （n=3）Tab.3 Content determ ination of ru tin and quercetin （ n= 3）

圖1 對照品和供試品的 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances and sam p les

3 討論

3.1 提取方法的確定 目前從槐花花蕾中提取蘆丁和槲皮素的方法主要有微波提取法［11］、 冷堿提取法［12］、 熱提冷 析法［13］、 超聲提取法［14］。 采用超聲提取法等有機溶劑提取的方法得到的雜質(zhì)較多，需要進一步分離純化才能得到純度較高的蘆丁和槲皮素。而采用堿水提取法既可得到純度較高的蘆丁和槲皮素，又避免了使用有機溶劑對環(huán)境的污染和破壞，故本實驗采用堿水提取法。

3.2 流動相的選擇 本實驗考察了甲醇-水、 乙腈-水等不同的流動相體系進行分析， 結(jié)果表明甲醇-水、 乙腈-水體系都能將蘆丁和槲皮素分離開， 但拖尾嚴(yán)重， 在甲醇-水系統(tǒng)中加入少量的磷酸可有效的改善拖尾現(xiàn)象，使峰型較好。由圖1可知，該色譜條件下， 蘆丁和槲皮素的分離度 R大于 1.5，分離效果好，且分離周期短。

3.3 對不同產(chǎn)地槐花花蕾蘆丁和槲皮素的比較

由表1知，不同產(chǎn)地槐花花蕾中蘆丁和槲皮素的含有量不同， 蘆丁在 21.48% ～28.21%之間， 槲皮素在 1.15% ～1.74%之間， 有一定的波動。 二者均以河南新鄭為最高，山東濟南次之，江蘇無錫最低。不同產(chǎn)地槐花花蕾中蘆丁和槲皮素的量有所差異，這與槐樹的生長環(huán)境 （日照時間、 溫度、 降雨量、土壤等）有密切關(guān)系。另外，當(dāng)蘆丁的量高時，槲皮素的量也高，反之相同。這可能與蘆丁和槲皮素在槐花花蕾中的生物合成途徑有關(guān)，蘆丁是由槲皮素和兩分子葡萄糖結(jié)合成糖苷形成的。

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Analysis of rutin and quercetin in flower buds of w ild Sophora japonica L.from different habitats by HPLC

ZHANG Jun-peng， ZHANG Bao-chan， LIRui-ming*， LIN Yin， LIU Yi， LIN Yin-kui，CHEN Xiao-lu
（ The First Affiliated Hospital of SunYat-Sen University， Cuangzhou 510080， China）

AIM To establish an HPLCmethod to determine rutin and quercetin in flower buds ofwild Sophora japonica L.from eighthabitats.METHODS Rutin and quercetin of flower buds of S.Japonica were extracted by alkaline solution，and were determined by HPLCmethod.Chromatography was performed on an Agilient HC-C18（ 4.6 mm×250 mm， 5 μm） at25 ℃ ， andmobile phasewas composed ofmethanol-0.4%phosphoric acid solution（ 52 ∶48） with a flow rate of0.9 m L/min.The detection wavelength was setat360 nm.RESULTS The linearity of rutin and quercetin were 2.5-80 μg/mL and 0.625-20 μg/mL，respectively，the average recoveries were 100.2%and 99.1%， and their RSD were2.1%and 1.1% （ n=6） ， respectively.The rutin content ranged from 21.48%to 28.21%， while quercetin content ranged from 1.15%to 1.74%.CONCLUSION There are some differences in the contents of rutin and quercetin in flower buds of S.japonica in different habitats.Of these habitats the contents of rutin and querectin in the flower buds from Henan province are the highest.

flower buds of Sophora japonica L.;rutin;quercetin

R284.1

:A

1001-1528（2014）11-2573-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.11.029

2013-11-21

廣東省中醫(yī)藥局科研項目 （20121145）

張俊鵬， 主管藥師， 研究方向: 醫(yī)院藥學(xué)。 E-mail:871105760@QQ.com

*通信作者: 李瑞明， 主管藥師， 研究方向: 醫(yī)院制劑。 E-mail:liruiming321@163.com