帕麗達(dá)·阿不力孜, 阿提坎木·瓦合甫, 叢媛媛, 米仁沙·牙庫(kù)甫, 李新霞, 熱娜·卡斯木

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830011）

HPLC法測(cè)定維藥神香草及混淆品大苞荊芥中齊墩果酸與熊果酸

帕麗達(dá)·阿不力孜, 阿提坎木·瓦合甫, 叢媛媛, 米仁沙·牙庫(kù)甫, 李新霞, 熱娜·卡斯木*

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830011）

目的 建立維藥神香草及習(xí)用品大苞荊芥中主要活性成分齊墩果酸和熊果酸定量測(cè)定方法。 方法 采用 HPLC法， 色譜柱為 YMC-ODS-A C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）; 流動(dòng)相為甲醇 -0.05 mol/L乙酸銨 （85 ∶15）， 體積流量1.0 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm; 柱溫 45 ℃。 結(jié)果 神香草中熊果酸與齊墩果酸在 80 ～480 μg（r=0.999 7）、 3.5 ～51.8 μg（r=0.999 5） 范圍內(nèi)， 大苞荊芥中在 5 ～100 μg（r=0.999 7）、 2 ～64 μg（r=0.999 8） 范圍內(nèi)兩者均有良好的線性關(guān)系， 平均回收率與 RSD均符合要求。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單、 快捷、 準(zhǔn)確可靠， 可為神香草及混淆品藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

神香草;大苞荊芥;齊墩果酸;熊果酸;高效液相色譜法

維藥神香草為唇形科植物硬尖神香草 Hyssopus cuspidatus Boriss.的干燥地上部分， 分布于我國(guó)新疆北部、 前蘇聯(lián)、 蒙古［1-2］。 在我國(guó)新疆地區(qū)神香草作為維吾爾族民間習(xí)用草藥，維吾爾語(yǔ)名為“祖發(fā)”， 被維醫(yī)廣泛用于治療咳嗽、 氣喘、 支氣管炎、 外傷和風(fēng)濕等癥［3］。 具有清除異常黏液質(zhì)、溫肺平喘、祛寒止咳、燥濕祛痰、發(fā)汗解毒、消炎退腫的功能［4］，主治濕寒性和黏液質(zhì)性呼吸器官疾病，如寒性哮喘、咳嗽感冒、濕性痰多、胸膜炎、 氣管炎、 肺 炎及水腫等病［5-9］。 全草 含有黃酮類、三萜類、烷烴類、甾體類和揮發(fā)油等成分［10-13］。 維藥 市 場(chǎng) 上 有 時(shí) 由 于 神 香 草 貨 源 短 缺，于是出現(xiàn)了其混淆品，主要為大苞荊芥。大苞荊芥為唇形科植物大苞荊芥 Nepeta bracteata Benth.的干燥全草， 維吾爾語(yǔ)名也稱 “祖發(fā)”， 為新疆維吾爾醫(yī)院的一種進(jìn)口藥材，具有鎮(zhèn)咳平喘、清熱利濕的作用，用于治療氣管炎癥見(jiàn)咳嗽氣喘、感冒發(fā)燒、 小便不利［14］。 由 于 2 種 藥材維 語(yǔ)名稱 相同，極易引起混用。但兩者是同科不同屬植物，而且化學(xué)成分和藥性各不相同。為確保臨床用藥安全、有效，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定神香草及混淆品大苞荊芥中齊墩果酸與熊果酸的 HPLC方法。 研究結(jié)果將為神香草及混淆品大苞荊芥藥材的鑒定質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津 LC-20AB高效液相色譜儀， SPD-20A紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器;KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器 （昆明市超聲儀器有限公司）; 梅特勒AL104 電子分析天平。

神香草藥材采自新疆阿勒泰地區(qū)，大苞荊芥購(gòu)自新疆維吾爾醫(yī)醫(yī)院，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院王兵教授鑒定， 均為唇形科 植 物硬尖神香 草 Hyssopuscuspidatus Boriss. 和 大 苞 荊 芥 Nepeta bracteata Benth.。 齊墩果酸 （批號(hào) 110709-201206），熊果酸（批號(hào) 110742-201220）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。 甲醇、 乙腈均為色譜純 （SIGMA-ALDRICH） 。

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜 條 件 YMC-ODS-A C18色 譜 柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 柱溫 45 ℃; 流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol/L乙酸 銨 （ 85 ∶15）， 體積流量 1.0 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm; 進(jìn)樣體積 20 μL。

2.2 對(duì)照品混合溶液的制備 分別精密稱取齊墩果酸對(duì)照品13.31mg與熊果酸對(duì)照品15.1mg， 置同一10 mL量瓶中， 用甲醇定容至刻度， 搖勻， 即得齊墩果酸與熊果酸對(duì)照品混合貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取神香草藥材粉末0.3 g（過(guò) 30 目篩）（編號(hào) HcB1）， 大苞荊芥 0.5 g（過(guò)30 目篩） （編號(hào) NbB1）， 分別置于具塞錐形瓶中， 各自加入15 m L甲醇， 稱定質(zhì)量， 超聲 （700 W， 40 kHz） 提取 20 min， 放冷， 再稱定質(zhì)量， 用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 神香草: 精密量取 “2.2”項(xiàng)下 對(duì) 照 品 混 合 貯 備 液 0.8、1.2、 1.8、 2.3、2.9、3.6 mL，分別置于 10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得到不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液。 大苞荊芥: 精密量取 “2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品貯備 液 0.04、0.08、 0.2、0.3、 0.8mL分 別 置 于10 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 搖勻，即得不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液。分別精密吸取上述兩種藥材不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液各 20 μL，按照上述色譜條件，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品齊墩果酸與熊果酸的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得神香草藥材齊墩果酸與熊果酸回歸方程分別為 Y= 13 500 874.491 7X+647 559.091 4 （r=0.999 5），Y=8 856 200X+658 719.33 （r=0.999 7）， 線性范圍為 3.5 ～51.8 μg， 80 ～480 μg。 大苞荊芥藥材齊墩果酸與熊果酸回歸方程分別為 Y= 28 667 780.890 8X+174 775.020 4 （r=0.999 8），Y=16 514 436.458 3X+472 226.432 3 （ r= 0.999 7）， 線性范圍為 2 ～64 μg， 5 ～100 μg。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密取 “2.2” 項(xiàng)下制備的對(duì)照品混合溶液 20 μL， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 分別測(cè)得峰面積值，計(jì)算出神香草齊墩果酸與熊果酸RSD分別為 2.2%和 2.7%; 大苞荊芥 RSD分別為2.6%和 2.4%， 表明儀器性能良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取神香草 （HcB1）與大苞荊芥 （NbB5） 同一樣品 6 份， 按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 按 “2.1” 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果神香草樣品中齊墩果酸與熊果酸含有量均值為0.001 6%（ RSD為2.6%） 和0.018 1%（RSD為 1.3%）; 大苞荊芥中齊墩果酸與熊果酸含有量均值為 0.000 4% （RSD為 3.5%） 和0.000 2%（RSD為 3.3%）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一神香草與大苞荊芥供試品溶液，分別于 0、 2、 6、8、 12、 24、 48 h進(jìn)樣測(cè)定， 神香草 RSD分別為 1.6%和 2.4%; 大苞荊芥 RSD為 3.6%和 4.3%， 結(jié)果表明該供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取神香草與大苞荊芥供試品溶液與對(duì)照品混合溶液各 20 μL， 按上述色譜條件， 分別進(jìn)樣， 記錄色譜圖， 結(jié)果見(jiàn)圖1。齊墩果酸與熊果酸達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5， 兩者理論塔板數(shù)都大于 8 000， 拖尾因子小于 1.5。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱取已測(cè)知齊墩果酸與熊果酸劑量的樣品神香草 （HcB1） 約 0.3 g，大苞荊芥 （NbB5） 0.5 g共 3 份， 按低、 中、 高質(zhì)量濃度分別加入齊墩果酸與熊果酸對(duì)照品貯備液，按供試品溶液的制備方法及色譜條件項(xiàng)下操作，計(jì)算回收率， 結(jié)果見(jiàn)表1和2。

表1 神香草加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for Hyssopus cuspidatus

圖 1 溶劑空白 （a）， 對(duì)照品 （b）， 神香草供試品 （c）， 大苞荊芥供試品 （d） 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of blank solvet（ a） ， reference substances（b） ， Hyssopus cuspidatus（ c） ， and Nepeta bracteata （ d）

表2 大苞荊芥加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for Nepeta bracteata

2.10 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的神香草藥材 0.3 g和大苞荊芥藥材 0.5 g， 按 “2.3” 項(xiàng)下的供試品溶液制備方法進(jìn)行樣品前處理， 按 “2.1” 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算樣品中齊墩果酸與熊果酸的量。 結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定神香草與習(xí)用品大苞荊芥藥材中齊墩果酸和熊果酸 HPLC方法， 該方法操作簡(jiǎn)單，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。神香草藥材中齊墩果酸平均總質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.103 3%， 熊果酸的平均總質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.934 9%， 習(xí)用品大苞荊芥中齊墩果酸平均總質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.015 6%和熊果酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.037 6%， 結(jié)果顯示神香草中齊墩果酸、 熊果酸量高于大苞荊芥中齊墩果酸、熊果酸量。因此，可用于神香草及其習(xí)用品大苞荊芥藥材的鑒定以及質(zhì)量控制。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determ ination resu lts

本實(shí)驗(yàn)參考 《中國(guó)藥典》 2010 年版， 考察了乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨 （67 ∶12 ∶21）、 甲醇-水-冰醋酸-三乙胺 （265 ∶35 ∶0.1 ∶0.05）、 甲醇-0.1mol/L乙酸銨 （85 ∶15 ） 以及甲醇-0.05 mol/L乙酸銨 （85 ∶15 ） 的 流 動(dòng) 相， 結(jié) 果 以 甲 醇-0.05 mol/L乙酸銨 （85 ∶15） 時(shí)，神香草與大苞荊芥樣品分離度和峰形都達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，出峰時(shí)間也比較適宜，為最佳色譜條件。

在提取溶劑中考察了乙醇、甲醇、乙酸乙酯對(duì)神香草和大苞荊芥中齊墩果酸和熊果酸的提取率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物中熊果酸與齊墩果酸量比甲醇、乙醇高，不過(guò)峰形差、分離度不好，因此選擇了甲醇為提取溶劑。

［1］ 國(guó)家中醫(yī)藥管理局 《中華本草》 編委會(huì).中華本草: 維吾爾藥卷［M］.上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 2005.

［ 2 ］ 中國(guó)科學(xué)院 《中國(guó)植物志》 編委會(huì).中國(guó)植物志: 第 66卷［M］.北京: 科學(xué)出版社， 1977:243.

［3］ 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn): 維吾爾藥分冊(cè)［S］.烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社， 1999.

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Determ ination of oleanolic acid and ursolic acid in Uygur m edicine Hyssopus cuspidatus Boriss.and its adulterant Nepeta bracteata Benth.by HPLC

PALIDA·Abulizi， ATIKANMU·Wahefu， CONG Yuan-yuan， MIRENSHA·Yakufu， LI Xin-xia，RENA·Ksimu*

（ College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

Hyssopus cuspidatus Boriss.;Nepeta bracteata Benth.;oleanolic acid;ursolic acid;HPLC

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2570-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.028

2013-12-03

新疆維吾爾自治區(qū) “十二五” 重大科技專項(xiàng) （201130105）

帕麗達(dá)·阿不力孜（1962—）， 女， 博士， 教授， 研究方向: 維藥生藥學(xué)及質(zhì)量控制。 Tel: （0991） 4363345

*通信作者: 熱娜·卡斯木（1962—）， 女， 教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向: 新疆特色藥材資源的開(kāi)發(fā)利用。 Tel: （0991） 4362473