姜 秋, 蔣海強, 李慧芬, 張學(xué)蘭（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 山東 濟南 250355）

[飲片炮制]

女貞子酒蒸過程中4種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分的動態(tài)變化

姜 秋, 蔣海強, 李慧芬, 張學(xué)蘭*（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 山東 濟南 250355）

目的 探討女貞子酒蒸過程中4 種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分的動態(tài)變化規(guī)律。 方法 采用 HPLC梯度洗脫的方法同時測定女貞子生品及酒蒸不同時間炮制品 （4， 8， 12， 16， 20， 24 h） 中特女貞苷、 橄欖苦苷、 女貞苷 G13、 女貞苷的量。 流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液， 梯度洗脫; 柱溫 25 ℃; 檢測波長 235 nm; 體積流量 1.0 m L/m in。 結(jié)果 特女貞苷、 橄欖苦苷、 女貞苷 G13、 女貞苷依次在 0.035 5 ～1.78 μg、 0.004 12 ～0.206 μg、 0.011 2 ～0.560 μg、0.001 46 ～0.072 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 （r＞0.999 5）， 平均回收率在 97.7% ～100.0%之間。 在 24 h 之內(nèi)， 隨著酒蒸時間的延長，4種苷類成分均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。結(jié)論 炮制對女貞子中裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分含有量具有顯著影響， 女貞子酒蒸后特女貞苷、 橄欖苦苷、 女貞苷 G13、 女貞苷均產(chǎn)生質(zhì)變。 研究結(jié)果為揭示女貞子的炮制機理提供了實驗依據(jù)。

女貞子;酒蒸;裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷;動態(tài)變化

女貞 子 為 木犀科植 物 女 貞 Ligubtrum lucidum Ait.的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、 明目烏發(fā)的功效。酒蒸女貞子可增強其滋補肝腎作用，故在臨床用藥中女貞子多以酒制品入藥［1］。 環(huán)烯醚萜苷類成分為女貞子的主要活性成分，具有增強免疫、 抗氧化、 抗炎、 降 血 糖、抗癌等作用［2-5］。 目前從女貞子中分離出的環(huán)烯醚萜苷類化合物有近30 種， 包括裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類和環(huán)烯醚萜苷類［6］?！吨袊幍洹?2010 年版規(guī)定， 女貞子中特女貞苷含有量不得少于 0.70%［7］。 本課題組前期研究表明，女貞子經(jīng)酒蒸和清蒸后， 特女貞苷量顯著降低［8］，但炮制對女貞子中其他環(huán)烯醚萜苷類成分的影響未見報道。 本研究采用 HPLC梯度洗脫的方法同時測定女貞子生品及酒蒸不同時間炮制品中4種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分特女貞苷、 橄欖苦苷、 女貞苷 G13和女貞苷的量，探討女貞子酒蒸過程中4種苷類成分的動態(tài)變化，為揭示女貞子酒蒸增效機理提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

Agilent1200 高效液相色譜儀 （ 美國 Agilent公司）;FA1604N型電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）;KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。 特女貞苷、 女貞苷 G13（為本實驗室自制， 純度均大于 98%）; 橄欖苦苷（上海源葉生物科技有限公司， 批號 20121029）;女貞苷 （云南西力生物科技有限公司，批號35897-92-8）; 黃 酒 （ 山 東 即 墨 黃 酒 廠， 批 號20120203， 酒精度 ≥16.5%）; 高 效 液 相用乙腈（色譜純）， 娃哈哈 純凈水，; 其余試劑均為分析純。

女貞子藥材購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為木犀科植物女貞 Ligubtrum lucidum Ait.的干燥成熟果實。生女貞子:取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈， 50℃烘干。 酒蒸女貞子: 取凈女貞子共6份， 各 100 g， 分別加黃酒 20 g（加水稀釋至40 g）， 置不銹鋼飯盒中， 悶潤 4 h， 密閉， 置蒸鍋中， 隔水蒸制 4、 8、12、16、 20、 24 h， 取出，50℃烘干。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）; 流動相為乙腈 （A） -0.1%甲酸溶液， 線性梯度洗脫 （0 ～22 min， 20% → 31% A）; 柱溫 25 ℃; 檢測波長 235 nm， 體積流量 1.0 mL/min， 進樣量 20 μL。 在該色譜條件下， 女貞子中4種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分與其他組分分離度良好， 色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 （A） 與女貞子生品 （B） HPLC圖譜Fig.1 Ch romatogram s of reference substances（ A） ， raw herbal pieces（ B）

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取特女貞苷、橄欖苦苷、 女貞苷 G13、 女貞苷對照品適量， 分別置于 10 m L、 10 mL、 10 m L、 50 m L量瓶中， 分別加 50%甲醇制成每 1 mL含特女貞苷 0.178 mg、 橄欖苦苷 0.103 mg、 女貞苷 G13 0.140 mg、 女貞苷0.036 4 mg的對照品溶液， 再分別精密吸取特女貞苷對照品溶液 5 mL、 橄欖苦苷對照品溶液 1 m L、女貞苷 G13 對照品溶液 2 mL、女貞苷對照品溶液1 mL， 置同一 10 mL量瓶中， 加 50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取女貞子生品及各炮制品粉末 （過 60 目篩） 各約 0.1 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 精密加入 50%甲醇 40 m L， 密塞，稱定質(zhì)量， 超聲提取 30 min， 取出， 放冷， 再稱定質(zhì)量， 用 50%甲醇補足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過，取續(xù)濾液， 以微孔濾膜 （0.45 μm） 濾過， 作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對照品溶液 0.04、 0.08、 0.4、 1、 2 m L， 置 2 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件，分別進樣 20 μL， 以色譜峰面積 （Y） 為縱坐標， 以進樣量 X（μg） 為橫坐標， 進行線性回歸， 結(jié)果各成分在各自進樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 見表1。

表1 4種成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of the four secoiridoid glycosides

2.5 精密度試驗 精取生女貞子供試品溶液20 μL，按上述色譜條件， 連續(xù)進樣 6 次， 測定特女貞苷、 橄欖苦苷、女貞苷 G13、女貞苷峰面積，結(jié)果 RSD分別為 1.1%、 1.4%、 1.3%、 1.7%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精取生女貞子供試品溶液20 μL，分別在0、 2、 4、 8、 12、 24 h 進樣測定特女貞苷、 橄欖苦苷、 女貞苷 G13、 女貞苷峰面積，結(jié)果 RSD分別為 1.2%、 1.3%、 1.4%、 2.0%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取生女貞子粉末 （過 60 目篩）6 份， 各約0.1 g， 精密稱定， 制備成供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷 G13、女貞苷的量， 結(jié)果 6 次測定的 RSD分別為 1.2%、 1.7%、1.5%、 2.1%。 表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗 取已測知含有量的生女貞子粉末 （ 過 60 目篩） 6 份，各約 0.1 g，精密稱定， 分別精密加入特女貞苷 1.184 mg/mL、 橄欖苦苷 0.165 mg/mL、 女貞苷 G13 0.510 mg/mL、 女貞苷 0.041mg/mL對照品溶液各 1 mL， 再以 50%甲醇補足至 40 mL， 按 “2.3”項下方法制備供試品溶液， 進樣分析， 結(jié)果見表2。

2.9 樣品測定 分別取女貞子生品及酒蒸不同時間炮制品粉末各約 0.1 g， 精密稱定， 依法制備成供試品溶液，精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各 20 μL， 注入液相色譜儀分析測定，按干燥品計算樣品中各指標成分， 結(jié)果見表3。

表 2 加樣回收率實驗結(jié)果 （n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

表3 4種成分測定結(jié)果Tab.3 Determ ination results of four secoiridoid glycosides

3 小結(jié)與討論

3.1 本研究采用 HPLC梯度洗脫的方法同時測定女貞子炮制品中特女貞苷、橄欖苦苷、 女貞苷 G13和女貞苷的量，結(jié)果表明，該方法靈敏可靠、重復(fù)性好。

3.2 研究結(jié)果顯示， 女貞子酒蒸后 4 種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分含有量均顯著降低， 且在 24 h內(nèi)，隨著酒蒸時間的延長，均呈逐漸降低的趨勢，說明女貞子經(jīng)酒蒸后特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、 女貞苷產(chǎn)生質(zhì)變。

3.3 環(huán)烯醚萜苷類成分性質(zhì)不穩(wěn)定， 易被水解［9］。 卜文文等報道， 橄欖苦苷經(jīng)酸、 堿水解后可獲得羥基酪醇［10］。 女貞子中裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物的結(jié)構(gòu)特點是其分子中的環(huán)烯醚萜部分大多通過其裂環(huán)上的酯鍵與紅景天苷或酪醇或羥基酪醇等苯乙醇類化合物相連。 如特女貞苷、 女貞苷 G13分子中的環(huán)烯醚萜部分通過酯鍵與紅景天苷相連，橄欖苦苷、女貞苷分子中環(huán)烯醚萜部分分別通過酯鍵與羥基酪醇和酪醇相連。本課題組前期研究表明，女貞子酒蒸后紅景天苷、酪醇、羥基酪醇量均顯著增加，特女貞苷在大鼠體內(nèi)可代謝為紅景天苷，據(jù)此推測， 酒蒸后特女貞苷、 女貞苷 G13 水解生成紅景天苷，橄欖苦苷水解生成羥基酪醇，女貞苷水解生成酪醇。紅景天苷、酪醇、羥基酪醇均含有酚羥 基，具有 較 強 的生 物 活 性［11-12］， 女 貞 子酒蒸后補肝腎作用增強分析與環(huán)烯醚萜苷類成分水解生成多種酚類化合物有關(guān)。

3.4 本實驗結(jié)果顯示， 女貞子中女貞苷 G13 含有量較高， 因此，將女貞苷 G13 的定量測定納入到女貞子飲片的質(zhì)量標準中很有必要。

［ 1 ］ 徐 蘋， 張學(xué)蘭.女貞子炮制歷史沿革研究［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2008， 32（3）:263-265.

［2］ 蔡 溱， 石力夫，胡晉紅， 等.特女貞甙體外對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化和自然殺傷細胞活性的影響 ［ J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 1998， 19（1）:76.

［ 3 ］ Han J， Talorete T P， Yamada P， et al.Anti-proliferative and apoptotic effects of oleuropein and hydroxytyrosol on human breast cancer MCF-7 cells［ J］ .Cytotechnology， 2009， 59（1）:45.

［ 4 ］ Al-Azzawie H F， Alhamdani M S.Hypoglycemic and antioxidanteffect of oleuropein in alloxan-diabetic rabbits［ J］.Life Sciences， 2006， 78（12） :1371.

［5］ 姜 斐， 姚 楠，錢士輝， 等.女貞子中8個化合物對胰島素抵抗 HepG2 細胞葡萄糖消耗的影響［ J］.海峽藥學(xué)，2010， 22（1）:164.

［6］ 趙麗麗， 馮毅凡.女貞子中三萜類和環(huán)烯醚萜類成分研究進展［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報， 2012， 28（1）:107.

［ 7 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010:43.

［8］ 張學(xué)蘭，侯 杰，李慧芬，等.炮制對女貞子中特女貞苷含量的影響［J］.中藥材， 2009， 32（4）:498-500.

［9］ 吳立軍.天然藥物化學(xué) ［ M］.北京: 人民衛(wèi)生出版社，2003:229.

［10］ 卜文文， 劉常金， 田仕夫.鹽酸法和 β-葡萄糖苷酶法水解橄欖葉提取物制備羥基酪醇的比較［J］.食品工業(yè)科技，2008， 20（2）:8-10.

［11］ 張明發(fā)， 沈雅琴.紅景天苷及其苷元酪醇的抗炎、 抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用［J］.藥物評價研究， 2013， 36（3）:228.

［12］ 劉威振， 張 興， 陳新建， 等.羥基酪醇藥理作用研究進展［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報， 2012， 28（6）:685-688.

Contents dynam ic changes of four secoiridoid glycosides under steam ing time spans w ith w ine in Ligubtrum lucidum Ait

JIANG Qiu， JIANG Hai-qiang， LIHui-fen， ZHANG Xue-lan*

（ Shangdong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

AIM To study the contents dynamic changes of four secoiridoid glycosides from Ligubtrum lucidum Ait affected by different steaming time spans with wine.M ETHODS The contents of specnuezhenide， oleuropein，G13 and ligustroside in Ligubtrum lucidum Aitwere determined by HPLC under Ligubtrum lucidum Ait and processing time span in 4，8， 12， 16，20 and 24 h.Themobile phase ofwater contained acetonitrile（A） and 0.1%formic acid water in gradient program.The column templerature was 25 ℃， and detection wavelength was set at 235 nm.The flow rate was1.0 mL/min.RESULTS Good linear（ r＞0.999 5 ） response ranges of specnuezhenide， oleuropein， G13， ligustroside were 0.035 5 ～1.78 μg，0.004 12 ～0.206 μg， 0.011 2 ～0.560 μg， 0.001 46 ～0.072 8 μg，respectively.Themean recoveries of five compoundswere 97.7% ～100.0%.In 24 h， as steaming time with wine prolong， the contents of four secoiridoid glycosides decreased throughtout the steaming process.CONCLUSION The contents of secoiridoid glycosides from Ligubtrum lucidum Ait changed significantly after processing.In Ligubtrum lucidum Ait， specnuezhenide，oleuropein，G13 and ligustroside were qualitative alteration as steaming with wine.This could provide experimental evidence to elucidate the research of processing Ligubtrum lucidum Ait.

Ligubtrum lucidum Ait;steaming with wine;secoiridoid glycoside;dynamic changes

R283

:A

1001-1528（2014）12-2561-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.026

2013-11-18

國家自然科學(xué)基金面上項目 （81373968）; 濟南市企業(yè)自主創(chuàng)新計劃項目 （201201036）

姜 秋 （1988—）， 男 （ 土家族） ， 碩士生， 研究方向: 中 藥新藥研發(fā) 與中藥 炮制原理。 Tel:18765880650 ， E-mail:jiangqiu09@163.com

*通信作者: 張學(xué)蘭 （1963 —） ， 女， 碩士， 教授， 研究方向: 中藥新藥研發(fā)與中藥炮制。 Tel:13406062766， E-mail:zhang8832440@ sina.com