潘 俊, 潘 聿, 肖 丹, 李志敏, 王元忠, 李晚誼*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所, 云南 昆明 650205； 2.云南中醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明 650500）

LC-MS/MS法同時測定滇龍膽中 4 種苯甲酸酯類成分

潘 俊1, 潘 聿2, 肖 丹1, 李志敏1, 王元忠1, 李晚誼1*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所, 云南 昆明 650205； 2.云南中醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明 650500）

目的 建立 LC-MS/MS 法同時測定滇龍膽中抗老年癡呆的 4 種主要成分 gentiside A， gentiside J， gentiside B， gentiside K的 量。 方 法 使 用 島 津 LC-MS/MS 8030 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀， 色 譜 柱 為 Shim-pack XR-ODS Ⅲ （ 75 mm ×2.0 mm，1.6 μm）; 流動相為甲醇-0.1%甲酸， 等度洗脫; 離子源為電噴霧電離源 （ ESI）， 采用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式。 結(jié)果Gentiside A， gentiside J， gentiside B， gentiside K分 別 在 39.0 ～444.4 μg/mL、 39.0 ～444.4 μg/mL、 59.0 ～444.4μg/mL、 26.0 ～444.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 相關(guān)系數(shù)為 0.998 9 ～0.999 6; 所測的滇龍膽根部中， 4 種苯甲酸酯類成分的含有量分 別為 0.284、 0.358、 0.654、 0.267 mg/g; 加樣 回收率為 98.1% ～ 102.6%， RSD為 0.7% ～1.7%。 結(jié)論 該方法專屬性好、 精密度高， 可用于滇龍膽中苯甲酸酯類成分的檢測。

滇龍膽; 老年癡呆; 苯甲酸酯;LC-MS/MS

滇龍膽 Centiana rigescens Franch.， 別名為滇龍膽草 （滇南本草）、 堅龍膽 （中國高等植物圖鑒）、小秦艽 （云南）， 是 《中國藥典》 2010 年版收錄的龍膽品種之一，也是云南著名道地藥材，具有清熱燥濕，瀉肝膽火的功效。主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物，以龍膽苦苷為代表;該類物質(zhì)具有保肝、健胃、鎮(zhèn)痛、抗病毒、促進細(xì)胞分裂、加快傷口愈合等多種 功效［1-4］。 近期研究發(fā)現(xiàn)，滇龍膽提取物中有一系列新穎結(jié)構(gòu)的苯甲酸酯類化合物，具有顯著的類似神經(jīng)生長因子活性，神經(jīng)營養(yǎng)作用和保護作用，是一種高效低毒的抗老年癡呆癥中藥活性組分［5-6］。

目前文獻報道多集中于龍膽中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷等的高 效液相色譜測定［7-8］， 而 對于龍 膽中苯甲酸酯類化合物的測定未見報道。 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （LC-MS/MS） 聯(lián)用技術(shù)具有高靈敏度、專屬性好、快速、高效的特點，已逐漸成為中藥微量成分定量分析的有效手段［9-11］。 本實驗 建立了 LCMS/MS 對滇龍膽中 4 種苯甲酸酯類成分 gentiside A， gentiside J， gentiside B， gentiside K的 測 定 方法，為滇龍膽質(zhì)量控制提供了強有力的保證和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-MS/MS 8030 超高效液相三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 （日本島津公司）， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-215 （ 瑞 士 BüCHI公 司）， 電 子 天 平 AL204-IC（ 梅特勒-托利多儀器有限公司）， Drict-Q5 超純水機 （ 法 國 Millipo公 司 ），HS-1026OD 超 聲 波 清洗器。

1.2 材料 對照品 gentiside A， gentiside B， gentiside J， gentisideK由浙江大學(xué)藥學(xué)院提供; 滇龍膽樣品采自云南，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所提供。甲醇、甲酸為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件

2.1.1 液相色譜條件 Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱 （75 mm×2.0 mm， 1.6 μm）; 流動相為甲醇-0.1%甲酸 （95 ∶5）， 等度洗脫， 平衡時間為6 min。 柱溫 40 ℃; 體積流量 0.45 mL/min; 進樣量 20 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源 （ESI）， 負(fù)離子化模式; 毛細(xì)管電壓為 4.5 kV; 干燥氣體、 霧化氣體為氮氣， 體積流量分別為 3.0 和 15 mL/min;碰撞氣體 （CID） 氬氣;DL管溫度 250 ℃， 加熱塊溫度 300 ℃; 產(chǎn)物離子掃描為 m/z135， 碰撞電壓 35 V。 定量分析采用多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM） 模式， 離子優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 液質(zhì)聯(lián)用方法分析目標(biāo)龍膽苯甲酸酯的優(yōu)化參數(shù)Tab.1 LC-MS/MS parameters （ MRM ） for the selected analytes

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取苯甲酸酯對照品 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K各適量， 精密稱定對照品 2 mg， 分別放置于 2 mL量瓶中， 加95%乙醇溶解并定容至刻度， 搖勻，即各對照品貯備液 （1 mg/m L）。 分別精密吸取各貯備液適量，依 次 稀 釋 得 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 666.6、 444.4、296.3、 197.5、 131.7、87.8、59、 39、 26 μg/mL的對照品貯備液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取滇龍膽干燥樣品 （包括根、 莖、 葉、 種子）， 粉碎后過 100 目篩。 稱取1.5 g樣品， 加 入 95% 乙醇 10 mL， 超聲提取40 min， 過濾， 濾液過 0.22 μm微孔濾膜， 即得。

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取不同質(zhì)量濃度的對照品溶液， 按上述 LC-MS 條件進樣測定， 記錄色譜圖。 以對照品質(zhì)量濃度 （x）為橫坐標(biāo)， 峰面積積分值 （y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 進行線性關(guān)系考察， 結(jié)果見表 2。 結(jié)果表明， gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 （r為 0.998 9 ～0.999 6）。

表2 4種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Linear regression data of gentisides

2.4 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液適量，按上述 LC-MS 條件連續(xù)進樣 5 次， 測定峰面積。結(jié)果 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K的 RSD分別為 1.1%、 1.2%、 1.0%、 1.8%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 取同一份滇龍膽根部樣品1.5 g， 共 6 份， 分別按 “2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 照上述 LC-MS/MS 條件進樣測定。 結(jié)果gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K的RSD分別為 2.2%、 3.0%、3.5%、 2.5%， 表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液適量，同一日內(nèi)每隔4 h 測定滇龍膽根樣品 （重復(fù)6 次）;連續(xù)3 d 同一時間測定滇龍膽根樣品 （重復(fù)6 次）。結(jié)果表明供試品溶液在室溫放置 3 d 以內(nèi) gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K基本穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表 3 日內(nèi)與日間穩(wěn)定性試驗 （ n=6）Tab.3 Intra-and inter-day precision of methods（ n=6）

2.7 回收率試驗 精密稱取同一滇龍膽根部樣品適量，共6份，分別精密加入一定量的對照品貯備液，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液， 測定4種化合物的峰面積，計算回收率，測定結(jié)果見表4。 結(jié)果顯示， 這 4種化合物的加樣回收率為98.1% ～102.4%， RSD為0.7% ～1.7%。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）Tab.4 Results of recovery tests（n=6）

2.8 樣品測定 取不同部位的滇龍膽樣品， 按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 照上述 LCMS/MS 條件進樣測定，記錄峰面積， 分別計算樣品中 gentiside A，gentiside J， gentiside B， gentiside K的量， 結(jié)果見圖 1， 圖 2 和表 5。

圖1 對照品二級離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Product ion scan spectra of the reference substances

圖2 對照品 （A） 和樣品 （B） 的總離子流色譜圖Fig.2 Total ions chrom atogram s of reference substances（A） and samples（B）

表5 滇龍膽不同部位苯甲酸酯的測定結(jié)果Tab.5 Contents of gentiside in different parts of G.rigescens

3 討論

本研究采用 LC-MS/MS 方法， 對滇龍膽中 4 種苯甲酸酯類成分 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K進行了同時測定， 操作簡單、快速，為滇龍膽質(zhì)量控制提供了新手段。

在一級全掃描 MS 圖中發(fā)現(xiàn)， 4 個化合物 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K在負(fù)離子模式下均易產(chǎn)生 ［M-H］-峰， 且響應(yīng)值較高。在流動相中加入適量的甲酸有助于化合物的離子化， 故對甲酸的用量進行了考察， 發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入1%的甲酸時，各化合物峰形較好，且響應(yīng)值穩(wěn)定。最終確定以甲醇-水 （1%甲酸） 為流動相等度洗脫。

結(jié)果表明， 這 4 種苯甲 酸 酯 化 合 物 gentiside A、 gentiside J、 gentiside B、 gentiside K在滇龍膽的根中含有量最高， 分別為 0.284、 0.358、 0.654、0.267 mg/g。莖中只含 gentiside J，葉中只含 gentiside K， 而種子中不含任何一種。本研究為建立滇龍膽藥材的質(zhì)量分析方法提供必要的參考依據(jù)，為滇龍膽藥材的充分利用提供有力的技術(shù)支持。

［1］ 李智敏， 劉 莉，李晚誼， 等.滇龍膽的藥用資源研究與開發(fā)進 展 ［ J］.云南 大學(xué) 學(xué) 報: 自然科 學(xué)版， 2009， 31（S1）:485-486.

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Sim ultaneous determ ination of four benzoate com pounds from Gentiana rigescens Franch.by LC-MS/MS

PAN Jun1， PAN Yu2， XIAO Dan1， LIZhi-min1， WANG Yuan-zhong1， LIWan-yi1*

（1.Instituteof Medicinal Plants， Yunnan Provincial Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205， China;2.Yunnan University of TCM， Kunming 650500， China）

AIM A specific liquid chromatography-ion trap mass spectrometric（ LC-MS/MS） method was developed thatallowed simultaneous determination of four components（ gentiside A，gentiside J， gentiside B，gentiside K） of anti-dementia in Centiana rigescens Franch.METHODS By using the LC-MS/MSmethod， the four compounds were separated on a Shim-pack XR-ODS Ⅲ column （75 mm×2.0 mm， 1.6 μm） with amobile phase consisted ofmethanol and water containing 0.1%formic acid with isocratic elution.Electrospray ionization source（ESI） was applied and operated in negative ionizationmultiple reactionmonitoringmodel.RESULTS The linear ranges of gentiside A， gentiside J， gentiside B and gentiside K were 39.0 ～444.4 μg/mL（r=0.999 6） ， 39.0 ～444.4 μg/mL（r=0.999 0）， 59.0 ～444.4 μg/mL（r=0.998 9） and 26.0 ～444.4 μg/mL（r=0.999 4）， respectively.The contents of four benzoate compounds in the rootof Centiana rigescens Franch，were0.284， 0.358，0.654， 0.267mg/g， respectively.The recoveries ranged from 98.1%to102.6%， and RSDswere in the range of 0.7% ～1.7%.CONCLUSION Themethod is specific and precise， and can be used for the determination of benzoate compounds in Centiana rigescens Franch.

Centiana rigescens Franch;Alzheimer's disease;benzoate;LC-MS/MS

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2550-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.023

2013-11-22

云南省科技計劃項目 （2012AE002）

潘 俊 （1982—）， 男， 助理研究員， 研究方向: 中藥質(zhì)量控制。 Tel:13987148730， E-mail:38435992@qq.com

*通信作者: 李晚誼 （1965 —） ， 女， 研究員。 研究方向: 中藥質(zhì)量控制。 Tel:13888784468， E-mail:wyli2012@126.com