姜建國(guó), 張西如, 張軼華, 宋更申

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院, 河北 石家莊 050011）

LC-MS/MS法檢查保健食品和中成藥中非法添加磺胺藥

姜建國(guó), 張西如, 張軼華, 宋更申

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院, 河北 石家莊 050011）

目的 建立 LC-MS/MS 方法檢查保健食品和中成藥中非法添加的 22 種磺胺類藥物。 方法 磺胺脒、 甲氧芐啶、磺胺二甲異嘧啶鈉、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲二唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺苯酰、磺胺喹沙啉、 磺胺苯吡唑、 磺胺硝苯和磺胺間二甲氧嘧啶的乙腈溶液的 HPLC分析， 采用 C18色譜柱， 梯度洗脫; 流動(dòng)相 A為 0.1%甲酸， 流動(dòng)相 B為乙腈， 體積流量 0.3 mL/min。 質(zhì)譜選擇正離子模式和 MRM掃描方式。 結(jié)果 通過(guò)比較樣品和對(duì)照品峰的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖可測(cè)定上述磺胺類藥物的最小檢出量為 1 pg。 結(jié)論 本法對(duì) 38 批保健食品和中成藥進(jìn)行分析，4批樣品出現(xiàn)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜與磺胺甲噁唑和甲氧芐啶對(duì)照品一致的圖譜。

磺胺類藥物; 非法添加;LC-MS/MS; 保健食品; 中成藥

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥，用于臨床已近50年， 它具有抗菌譜較廣、 性質(zhì)穩(wěn)定、 使用簡(jiǎn)便、 生產(chǎn)時(shí)不耗用糧食等優(yōu)點(diǎn)。 特別是 1969 年抗菌增效劑——甲氧芐氨嘧啶 （TMP） 發(fā)現(xiàn)以后，與磺胺類聯(lián)合應(yīng)用可使其抗菌作用增強(qiáng)、治療范圍擴(kuò)大，因此，雖然有大量抗生素問(wèn)世，但磺胺類藥物仍是中藥的化學(xué)治療藥物。由于磺胺類藥主要經(jīng)肝代謝滅活，形成乙?；锏娜芙舛冉档?，因此，易引起血尿、結(jié)晶尿及腎損害，其不良反應(yīng)還有惡心、嘔吐、皮疹、發(fā)熱、溶血性貧血、粒細(xì)胞減少、肝臟損害等，故肝腎功能差的尿路感染患者應(yīng)慎用。近年來(lái)，在具有止咳平喘中藥制劑和保健品中摻雜化學(xué)合成藥物的情況時(shí)有發(fā)生，對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成嚴(yán)重危害?，F(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)只能分別檢查單個(gè)或幾個(gè)藥物，對(duì)保健食品和中藥制劑的定性檢查效率不高， 目前 HPLC、 LC/MS 和 GC/MS技術(shù)已廣泛用于同時(shí)測(cè)定多種成分［1-10］，且已有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè) 定 磺胺 類 藥 物［11-14］。 本 實(shí) 驗(yàn) 建立 可 同 時(shí)檢查 22 種磺胺類藥物的 LC-MS/MS 檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 API3200 型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 （美國(guó) Applied Biosystems公司）;Milli-Q去離子水止水系統(tǒng) （ 美國(guó) SPEXCertiPrep 公司）; 磺胺脒 （SGN， 批號(hào) 10916）、 甲氧芐啶 （TMP， 批號(hào)00802）、 磺胺二甲異嘧啶鈉 （SIM，批號(hào) 20727）、磺胺醋酰 （SAA， 批號(hào) 00521）、 磺胺嘧啶 （SDZ，批號(hào) 00818）、 磺胺吡啶 （SPD， 批號(hào) 10121）、 磺胺 甲 嘧 啶 （ SMR，批 號(hào) 10903）、 磺 胺 二 甲 唑（SMO，批號(hào) 90928）、 磺胺二甲嘧啶 （SDM， 批號(hào)10310）、 磺胺甲氧嗪 （ SMP， 批號(hào) 00514）、 磺胺甲二唑 （SMT， 批號(hào) 20324）、 磺胺對(duì)甲氧嘧啶（SMD，批號(hào) 20411）、 磺胺間甲氧嘧啶 （SMM， 批號(hào) 01104）、 磺胺氯噠嗪 （SCP， 批號(hào) 20621）、 磺胺多辛 （SDX， 批號(hào) 01109）、 磺胺甲噁唑 （SMZ，批號(hào) 10405）、 磺胺異噁唑 （ SFZ， 批號(hào) 10319）、磺胺 苯 酰 （ SBA，批 號(hào) 00416）、磺 胺 喹 沙 啉（SQX， 批 號(hào) 80303）、 磺 胺苯吡唑 （ SPA， 批號(hào)00216）、 磺胺硝苯 （SAN， 批號(hào) 10310） 和磺胺間二甲氧嘧啶 （ SAX， 批號(hào) 20104） 對(duì)照品均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于 99.0%。 樣品由本院提供。

1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取 22 種對(duì)照品適量， 加乙腈溶解并制成質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL的貯備液。 用乙腈 -0.1%甲酸水 （20 ∶80） 配制成混合對(duì)照品溶液并稀釋至所需要的系列質(zhì)量濃度， 取系列溶液10 μL進(jìn)樣測(cè)定， 以定量提取離子對(duì)的積分值制成質(zhì)量濃度-面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品溶液的制備 取所需測(cè)定樣品10 片 （片劑、 膠囊和散劑）， 將內(nèi)容物研細(xì)， 精密稱取0.1 g至 50 mL的量瓶中， 加乙腈適量， 超聲 （250 W，40 kHz） 提取 30 min， 放至室溫并用乙腈稀釋至刻度， 搖勻， 用 0.2 μm的濾膜過(guò)濾， 精密量取濾液適量， 用乙腈-0.1%甲酸水 （20 ∶80） 稀釋至線性范圍內(nèi)質(zhì)量濃度， 搖勻， 即得。 取 10 μL， 進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 色 譜 條 件 Altantis T3 色 譜柱 （2.1 mm× 100 mm， 3 μm）; 流動(dòng)相 A為 0.1%甲酸， 流動(dòng)相B為乙腈; 梯度洗脫 （0 ～5 min， 0.5% ～10%B; 5 ～25 min， 10% ～50%B;28 min 恢復(fù)到初始， 平衡 5 min）; 體積流量 0.3 mL/min; 柱溫 30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 （ESI）; 離子噴霧電壓 （IS） 5.5 kV; 離子源溫度 （TEM） 550 ℃;氣簾 氣 （ CUR） 10 L/min; 霧 化 氣 （ GAS1） 40 L/min; 輔助氣 （GAS2） 30 L/min; 采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM）。 正離子化模式選擇和提取離子選擇均以靈敏度高、穩(wěn)定性好為前提條件。各化合物的定性和定量離子見(jiàn)表 1， 色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系考察 取 “1.2” 項(xiàng)所示貯備液逐一稀釋成系列質(zhì)量濃度溶液 10 μL進(jìn)樣，計(jì)算各成分的線性方程，相關(guān)系數(shù)和 RSD值 （n=6）， 詳見(jiàn)表2。

3.2 精密度試驗(yàn) 取 “表 2” 22 種藥物的中間濃度， 分別進(jìn)樣 10 μL， 連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 記錄色譜圖， 分別計(jì)算 RSD （n=6）， 最大值為 1.8%。

圖 1 22 種磺胺類藥物的選擇離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of 22 kinds of sulfonam ides in SIM mode

3.3 溶液的穩(wěn)定性 分別取 “表 2”22 種藥物的中間濃度置于室溫下放置， 于 0、 2、 4、 6、 8 h，取 10 μL進(jìn)樣， 記錄色譜圖， 峰面積 RSD （n=6）最大值為1.5%， 表明22 種溶液在 8 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

3.4 檢出限 將 22 種對(duì)照品貯備液逐級(jí)稀釋， 以S/N=3 計(jì)算檢出量， 以上藥物的檢出量最低為1 pg。

表 2 22 種藥物的線性方程， 線性范圍， 線性相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear equation， linear range， correlation coefficient and recovery of 22 drugs

4 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用建立的方法對(duì)我所近 5年檢查的38批保健食品和中成藥進(jìn)行分析，4批樣品出現(xiàn)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜與磺胺甲噁唑和甲氧芐啶對(duì)照品一致的圖譜，進(jìn)一步經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，其紫外光譜亦與磺胺甲噁唑和甲氧芐啶對(duì)照品一致，判定這4批樣品中非法添加了磺胺甲噁唑和甲氧芐啶，其余樣品均未檢出。見(jiàn)表3。

表 3 22 種藥物在樣品中的測(cè)定結(jié)果 （n=3）Tab.3 Results of 22 drugs in samples（ n=3）

5 討論

5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的配制 磺胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)為對(duì)氨基苯磺酰胺，大多數(shù)此類藥物在水中的溶解度較低，且對(duì)光不穩(wěn)定，所以應(yīng)使用乙腈作為溶劑配制磺胺類對(duì)照溶液，并避光保存。在液相色譜分析中，樣品稀釋一般都使用有機(jī)溶劑和水的混合液體。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙腈-水或甲醇-水的混合溶液時(shí)，稀釋溶液中有機(jī)溶劑的比例高于色譜洗脫程序起始時(shí)有機(jī)相比例的2倍時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)色譜峰分裂現(xiàn)象，各成分的峰形對(duì)稱，無(wú)拖尾現(xiàn)象。

5.2 樣品的提取 由于保健食品和中成藥多為片劑、膠囊、軟膠囊和顆粒劑等，且大多為復(fù)方制劑，中成藥中每味中藥材的成分又十分復(fù)雜，對(duì)分析方法的選擇性要求更高， 因此本實(shí)驗(yàn)采用 LCMS/MS 對(duì)其中添加的磺胺類藥物進(jìn)行定性分析，并定量測(cè)定。

樣品的提取方法不盡相同，對(duì)片劑、膠囊劑等固體制劑可以直接研細(xì)，稱取細(xì)粉加乙腈溶解、過(guò)濾即可，對(duì)含糖較多的顆粒劑用乙腈溶解時(shí)，可以消除蔗糖的干擾，有效的保護(hù)色譜柱，提取方法操作簡(jiǎn)單。

5.3 樣品的測(cè)定結(jié)果 從表 3 中可以看出， 4 批樣品被檢測(cè)出磺胺甲噁唑和甲氧芐啶，其中3批樣品為中成藥散劑，且其中一批檢出量較高，檢出率為 10.5%。因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)中成藥非法添加的控制。

5.4 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中，使用幾種不同的反相色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有的色譜洗脫條件下， Altantis T3 （2.1 mm×100 mm， 3 μm）由于填料顆粒細(xì)，使峰形更加對(duì)稱尖銳， 信噪比更高，因此最終選擇該色譜柱作為分離柱?？梢詫⑼之悩?gòu)體及母離子和碎片離子一致的藥物區(qū)分開(kāi)，使定性更準(zhǔn)確，在流動(dòng)相中加入適量甲酸，可以提高靈敏度， 經(jīng)試驗(yàn)當(dāng)甲酸的使用量在 0.1%為宜。

5.5 建立了 HPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定 22 種磺胺類藥物的方法，記錄了所測(cè)化學(xué)藥的紫外光譜、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖，使用質(zhì)譜儀自身所配軟件儲(chǔ)存上述信息，并錄入相應(yīng)名稱、結(jié)構(gòu)等信息，當(dāng)分析未知物時(shí)，可先根據(jù)采集的信息在庫(kù)中搜索匹配的藥物，再用相應(yīng)的對(duì)照品進(jìn)樣分析，既減少了交叉污染的可能性，又可以節(jié)省大量的摸索試驗(yàn)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)對(duì)未知成分進(jìn)行確認(rèn)的目的，方法操作簡(jiǎn)便、快速可靠、靈敏度高，可以用于監(jiān)測(cè)保健食品和中成藥中的違法添加化學(xué)藥的情況，為市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支持。

［ 1 ］ 徐守竹， 謝艷華， 張曉衛(wèi)， 等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定腎康注射液 5 種蒽醌類成分［J］.中成藥， 2013， 35 （1）:90-93.

［ 2 ］ 王 蕾， 談瑄忠， 毛春芹， 等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定淫桂通便 顆 粒 中 6 種 成 分 ［ J］.中 成 藥， 2013， 35 （2 ）: 293-296.

［ 3 ］ 梁 朔， 張振秋， 米寶麗， 等.HPLC法同時(shí)測(cè)定決明子中 6 種蒽醌成分［J］.中成藥， 2013， 35（3）:584-588.

［ 4 ］ 張子建， 孫冬曉， 王 婧， 等.LC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定口炎清 顆 粒 中 8 種 成 分 ［ J］.中 成 藥， 2013， 35 （5 ）: 952-956.

［ 5 ］ 李楊杰， 歐國(guó)燈， 李泳雪， 等.HPLC-MS-MS 法測(cè)定降壓類中成藥和保健食品中非法添加氨氯地平和樂(lè)卡地平的研究［J］.中成藥， 2013， 35（5）:956-960.

［ 6 ］ 姜建國(guó)， 張西如， 張軼華， 等.LC-MS/MS 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)快速識(shí)別抗感冒藥中 15 種有效成分［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2013，48（1）:94-97.

［ 7 ］ Zhang Xiru， Zhang Yihua， Jiang Jianguo， etal.Simultaneous determination of18 effective components in chemicalmedicines for cold with HPLC-MS/MS［ J］.Asian JChem， 2013， 25（5） : 2797-2800.

［ 8 ］ 高 青， 車寶泉， 戴 紅， 等.LC-MS/MS 法檢查中藥制劑及保健食品中非法添加的 16 種鎮(zhèn)靜催眠藥物［ J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 39（2）:142-146.

［ 9 ］ 莊曉慶.HPLC法測(cè)定止咳類中藥制劑中非法添加成分磺胺甲噁唑［J］.齊魯藥事， 2012 ， 31（9）:509-511.

［10］ 候建波， 謝 文， 陳笑梅， 等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-同位素稀釋法同時(shí)測(cè)定豬肉中 54 種藥物殘留［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2012， 33（1）:48-54.

［11］ 何春紅.食品中磺胺類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.綠色科技， 2013（2）:153-155.

［12］ 范瑩瑩， 其 魯， 楊樹(shù)民.HPLC-MS 聯(lián)用法測(cè)定豬肉組織中 5 種磺胺類藥物殘留［J］.現(xiàn)代儀器， 2008（1）:27-30.

［13］ Gao Shiqian， Yang Xiao， Yu Wei， et al.Ultrasound-assistedionicliquid ionic liquid-dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of sulfonamides in infant formulamilk powder using high-performance liquid chromatography［ J］ .Talanta， 2012， 99:875-882.

［14］ Herrera-Herrera A V， Hernández-Borges J， Borges-Miquel T M， et al.Dispersive liquid-liquid microextraction combined with ultra-high performance liquid chromatography for the simultaneous determination of 25 sulfonamide and quinolone antibiotics in water samples［ J］ .J Pharm Biomed Anal， 2013， 75: 130-137.

Detecting illegally added sulfonam ides in health foods and herb preparations by LC-MS/MS

JIANG Jian-guo， ZHANG Xi-ru， ZHANG Yi-hua， SONG Geng-shen

（ Hebei Provincial Institute for Drug Control， Shijiazhuang 050011， China）

AIM To establish LC-MS/MSmethod to detect illegally added twenty-two kinds of sulfonamides in health foods and herb preparations.METHODS The analysis of the acetonitrile solutions of SGN， TMP， SIM，SAA， SDZ， SPD， SMR， SMO， SDM， SMP， SMT，SMD，SMM， SCP， SDX， SMZ， SFZ， SBA，SQX，SPA，SAN， and SAX were performed on C18chromatographic column in a gradient elution mode.Mobile phase consisted of 0.1%formic acid （ A phase） and acetonitrile（ B phase） ， the flow rate was 0.3 mL/min.Cationic mode and MRM scanning were selected in NM analysis.RESULT Comparison wasmade between the primary and secondarymass spectra of samples and reference compounds.The lower detection limit of sulfonamides was 1 pg.CONCLUSION Thismethod successfully detects the presence of SMZ and TMP in the primary and secondary mass spectra in four samples from thirty-eight kinds of health foods and herb preparations.

sulfonamides;illegally added;LC-MS/MS;health foods;herb preparations

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2542-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.021

2013-11-27

姜建國(guó) （1965—）， 碩士， 主任藥師， Tel: （0311） 85212004-8040， E-mail:49567976@qq.com