劉瀟瀟, 周穎儀, 楊立偉, 王 磊

（1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所, 廣東 廣州 510180； 2.暨南大學(xué)藥學(xué)院, 廣東 廣州 510632）

清開靈系列制劑的氨基酸色譜指紋圖譜

劉瀟瀟1, 周穎儀1, 楊立偉1, 王 磊2*

（1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所, 廣東 廣州 510180； 2.暨南大學(xué)藥學(xué)院, 廣東 廣州 510632）

目的 建立清開靈系列制劑 （注射液、 軟膠囊、 膠囊、 顆粒） 的氨基酸色譜指紋圖譜。 方法 樣品與 2，4-二硝基氟苯衍生化反應(yīng)， Venusil AA色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm， Agela） ， 以乙腈與 N，N-二甲 基甲酰 胺 -0.025 mol/L醋酸鈉 （1 ∶100， 乙酸調(diào) pH6.4） 為流動(dòng)相， 梯度洗脫， 檢測(cè)波長(zhǎng) 360 nm， 體積流量 1.0 mL/min， 柱溫 25 ℃。結(jié)果 建立了清開靈注射液、 軟膠囊、 膠囊和顆粒等劑型的氨基酸色譜指紋圖譜， 并指認(rèn)了其中 15 個(gè)共有峰 （門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、結(jié)氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、 組氨酸、 賴氨酸、 苯丙氨酸）， 并對(duì)氨基酸類成分的歸屬進(jìn)行了探討。 結(jié)論 本研究建立的氨基酸色譜指紋圖譜基本能控制清開靈系列制劑中的水牛角、珍珠母及板藍(lán)根的內(nèi)在質(zhì)量。

清開靈系列制劑;氨基酸;色譜指紋圖譜

清開靈系列制劑，包括注射液、軟膠囊、膠囊、顆粒，均為國(guó)家基本藥物目錄品種，由膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷、水牛角、珍珠母、梔子、板藍(lán)根、金銀花八味藥組成，具有清熱解毒，化痰通絡(luò)，醒神開竅等功效，主要用于急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、腦出血、急性氣管炎、高熱等病癥［1-6］。 清開靈注射 液來源 于安宮牛黃丸組方， 顆粒和膠囊均為注射液的仿制劑型。近年來，臨床上關(guān)于清開靈注射液引起不良反應(yīng)的報(bào)道時(shí)有發(fā)生，究其原因之一其現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，難以有效控制質(zhì)量［7-8］。 注射液和膠囊劑 的現(xiàn)行 標(biāo)準(zhǔn)均 收載于 《 中國(guó)藥典》2010 年版一部［1-2］， 顆粒劑的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收 載 于 部 頒 標(biāo) 準(zhǔn)［4-6］， 其 系 列 標(biāo) 準(zhǔn) 中， 對(duì) 膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷、梔子、金銀花均有較明確的質(zhì)控指標(biāo)。板藍(lán)根、水牛角和珍珠母均含有豐富的氨基酸類成分［9］，三者總氨基酸約占清開靈注射液總固 體的 20%［10-11］， 但 系列 標(biāo) 準(zhǔn) 中， 僅 通過總氮量的測(cè)定來控制氨基酸類成分，顯然這種方法的準(zhǔn)確性和專屬性都值得商榷。因此，建立專屬性較強(qiáng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法對(duì)于水牛角、珍珠母及板藍(lán)根的控制非常必要。本實(shí)驗(yàn)利用氨基酸柱前衍生化反應(yīng)的方 法［12-14］， 建立 了 清 開靈 系 列 制劑 的 氨 基酸類成分指紋圖譜，并對(duì)7個(gè)生產(chǎn)廠家4種劑型84批樣品進(jìn)行了色譜指紋圖譜研究分析和比較，同時(shí)指認(rèn)了其中15個(gè)共有指紋峰，對(duì)其歸屬也進(jìn)行了探討。本研究建立的氨基酸色譜指紋圖譜基本能控制清開靈系列制劑中的水牛角、珍珠母及板藍(lán)根的內(nèi)在質(zhì)量，以期完善該系列制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，也為進(jìn)一步探討引起其質(zhì)量差異的原因奠定基礎(chǔ)，以保證該藥的質(zhì)量和臨床療效穩(wěn)定。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 1100 系列 （ 包括四元泵、 UV檢測(cè)器、 柱溫箱、 自動(dòng)進(jìn)樣器、 工作站）; Millipore純水儀。 乙腈為色譜純 （ Merck， 德國(guó)）;水為純凈水;N，N-二甲基甲酰胺、 醋酸鈉、 2，4-二硝基氟苯、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀均為分析純。

16 種 氨 基酸對(duì)照品即門冬氨 酸 （140691-200401）、 谷 氨 酸 （ 140690-200401 ）、 絲 氨 酸（140688-200401 ）、 甘 氨 酸 （ 140689-200401 ）、 蘇氨 酸 （ 140682-200401 ）、 脯 氨 酸 （140677-200405）、 丙 氨 酸 （ 140680-200401 ）、 結(jié) 氨 酸（ 140681-200401 ）、 甲 硫 氨 酸 （ 140684-200401 ）、胱氨 酸 （140632-200502 ）、 異 亮 氨 酸 （140683-200401）、 亮 氨 酸 （140687-200401 ）、 色 氨 酸（140686-200401）、 組氨酸 （890-200001）、 賴氨酸（ 140673-200405 ）、 苯 丙 氨 酸 （ 140676-200405 ），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。清開靈系列制劑分別來源于國(guó)內(nèi) 7家生產(chǎn)企業(yè)， 共 84 批， 其中注射液 44 批、 軟膠囊 10 批、 膠囊 16 批、 顆粒14批。

1.2 色 譜 條 件 采 用 Venusil AA （ 250 mm × 4.6 mm， 5 μm） 色譜柱，流動(dòng)相為乙腈 （A） -N，N-二甲基甲酰胺 -0.025 mol/L醋酸鈉 （1 ∶100，乙酸調(diào) pH 6.4） （B）， 梯度洗脫 10%A→43%A→43%A，相應(yīng)的時(shí)間周期為 0→60 min→70 min），檢測(cè)波長(zhǎng)為 360 nm; 體積流量 1.0 mL/min; 柱溫25 ℃。 理論塔板數(shù)按亮氨酸峰計(jì)， 應(yīng)不低于5 000。

1.3 溶液的制備

1.3.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取 16 種氨基酸對(duì)照品適量， 加水制成 1 mg/mL的各單標(biāo)溶液，再分別精密吸取各單標(biāo)溶液1 m L于20 m L量瓶中，加水制成每 1 mL分別含各氨基酸 0.05 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

1.3.2 注射液供試品溶液 將本品混勻， 即得。

1.3.3 口服制劑供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物， 混勻， 膠囊和軟膠囊各取約 0.4 g、顆粒劑取約 2.0 g（有糖型）或 1.0 g（無糖型），置具塞錐形瓶中， 精密加水 10 mL， 稱定質(zhì)量， 超聲處理 15 min， 加熱回流 30 min， 取出， 旋搖使分散，放冷，稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心15 min， 取上清液濾過，取續(xù)濾液， 即得。

1.4 衍生化反應(yīng) 分別精密量取對(duì)照品溶液與各供試品溶液各 1 mL， 置 25 m L量瓶中， 加入 0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液 2 mL與 1%2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液 1.5 mL，置 60 ℃水浴中放置 90 min， 取出，放冷， 加磷酸鹽緩沖液 （分別取磷酸二氫鉀6.8 g與氫氧化鉀1.36 g混溶于1 000 m L水中， 用磷酸調(diào) pH為7.0， 即得。）稀釋至刻度， 搖勻， 用微孔濾膜濾過，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法、 衍生化反應(yīng)和色譜條件的優(yōu)化 注射液為水溶液樣品，直接取樣進(jìn)行衍生化反應(yīng)后測(cè)定。根據(jù)注射液和各口服制劑的處方，以其供試品溶液1 mL與注射液供試品溶液1 mL中板藍(lán)根、水牛角和珍珠母的處方量基本一致來調(diào)整確定膠囊、軟膠囊和顆粒的取樣量。樣品提取過程中，比較了超聲、加熱回流等方式，結(jié)果表明，僅超聲或加熱回流提取，不能將有效成分完全提出，特別是對(duì)于軟膠囊樣品，方法的重復(fù)性較差，故最后采用先超聲提取將樣品均勻分散于溶液中，再加熱回流提取的方法，可完全提出有效成分。根據(jù)文獻(xiàn) ［12-14］， 衍 生 化 反 應(yīng) 在 60 ℃ 水 浴 中 放 置60 min， 本實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間 30、 60、 90 min 和衍生化試劑 1%2，4-二硝基氟苯 （DNFB） 的乙腈溶液的加入量 0.5、 1.0、 1.5、 2.0 mL，試驗(yàn)表明， 反應(yīng)時(shí)間為 60 min 和 90 min 時(shí)， 各色譜峰峰面積相當(dāng)且不再增加。 加入量為 0.5 mL時(shí)， 衍生物產(chǎn)率低， 加入量為 2.0 mL時(shí)， DNFB副產(chǎn)物 2，4-二硝基苯酚的峰面積太大， 加入量為 1.0 mL和1.5 mL時(shí)， 衍生化反應(yīng)完全且分離效果較理想。故本實(shí)驗(yàn)選用 1%DNFB的乙腈溶液的加入量為1.5 mL，反應(yīng)時(shí)間為 90 min。

由于氨基酸的極性不同，考察了不同的梯度洗脫程序，當(dāng)初始流動(dòng)相中乙腈的比例較高時(shí)，絲氨酸不易分離;當(dāng)初始流動(dòng)相中乙腈的比例較低時(shí)，甘氨酸和蘇氨酸的峰形對(duì)稱性差，分離度較低?？疾炝瞬煌闹鶞?（22 ℃、25 ℃、28 ℃），柱溫較高時(shí)，異亮氨酸與亮氨酸不能有效分離?？疾炝瞬煌?pH （6.2、 6.4、 6.6、 6.8）， pH較低時(shí)， 甘氨酸和蘇氨酸、 丙氨酸與脯氨酸分離度較低;pH較高時(shí)，賴氨酸色譜峰拖尾嚴(yán)重。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證 本實(shí)驗(yàn)對(duì) 7 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的清開靈系列制劑 84批樣品進(jìn)行了對(duì)比測(cè)定。經(jīng)對(duì)比確定 15 個(gè)峰為各批供試品共有 （色譜峰1 ～15），且峰面積較為穩(wěn)定，定為共有指紋峰。按 “1.3” 項(xiàng)下供試品溶液的制備和 “1.4” 項(xiàng)下衍生化反應(yīng)，分別平行配制5份清開靈注射液、軟膠囊、 膠囊和顆粒的供試品溶液， 按 “1.2” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以指紋峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算 RSD， 考察方法的重復(fù)性; 同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，以指紋峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算 RSD， 考察儀器的精密度; 取供試品溶液， 在 12 h之內(nèi)不同時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)， 以指紋峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算 RSD， 考察方法的穩(wěn)定性。重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性結(jié)果見表1。 結(jié)果表明，清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜測(cè)定方法具有可信的精密度和重復(fù)性， 在 12 h內(nèi)樣品穩(wěn)定，可以獲得可靠的指紋圖譜。

表1 指紋圖譜的方法學(xué)驗(yàn)證Tab.1 Evaluation of the fingerprin tm ethod

2.3 專屬性考察 精密量取水 1 mL，置 25 mL量瓶中， 按 “1.4” 項(xiàng)下進(jìn)行衍生化反應(yīng)， 得空白供試品溶液， 按 “1.2” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。 結(jié)果表明， 保留時(shí)間 16.8 min 處的色譜峰為 2，4-二硝基苯酚［12］，計(jì)算指紋圖譜相似度時(shí)扣 除該色 譜峰。處方中的其他化學(xué)成分、輔料及衍生化試劑對(duì)測(cè)定均無干擾 （見圖 1）。

2.4 色譜峰的指認(rèn) 通過比較 16 個(gè)氨基酸對(duì)照品的色譜保留時(shí)間，對(duì)清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜中的絕大多數(shù)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。其中，脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、結(jié)氨酸、亮氨酸、門冬氨酸的峰面積較高，與文獻(xiàn) ［9-10］ 報(bào)道的清開靈注射液中氨基酸的測(cè)定結(jié)果較一致，說明使用不同的柱前衍生化試劑 （ 異硫氰酸苯酯［9］、 鄰苯二甲醛和9-芴甲基氯甲酸酯［10］） 均能使清開靈注射液中的氨基酸完全衍生化，得到較準(zhǔn)確的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，將柱前衍生化法應(yīng)用于清開靈系列其他固體制劑，結(jié)果表明該法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于清開靈其他制劑的氨基酸指紋圖譜的建立和應(yīng)用。另外，組氨酸 （His）和苯丙氨酸 （Phe） 的保留時(shí)間相同。

圖1 氨基酸混合對(duì)照品溶液 （A）、 清開靈注射液 （B）、清開靈膠囊 （C）、 清開靈顆粒 （D）、 清開靈軟膠囊 （E） 和空白溶液 （F） 的 HPLC氨基酸指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerp rint of am ino acids reference solution（A） ， Qingkailing In jection （ B）， Q ingkailing Capsules（ C） ， Qingkailing Granules（ D） ， Qingkailing Soft Capsules（ E） and b lank solution（ F）

2.5 氨基酸成分歸屬的探討 為明確清開靈系列制劑氨基酸指紋圖譜中鑒定色譜峰的藥材歸屬，將成品指紋圖譜與板藍(lán)根、水牛角、珍珠母中間體的氨基酸色譜圖對(duì)照，比較色譜峰的保留時(shí)間以及DAD的光譜圖， 確認(rèn)了這 15 個(gè)氨基酸共有指紋峰的來源和歸屬，列于表2中。可見，本實(shí)驗(yàn)所得清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜的色譜峰成分基本上來自于板藍(lán)板和水牛角水解液。據(jù)報(bào)道，珍珠母中也有較 豐富 的 氨 基酸 類 成 分［15-16］， 但本 實(shí) 驗(yàn) 測(cè)定的珍珠母中間體的氨基酸色譜圖中色譜峰較少，其原因有待進(jìn)一步研究。

表2 氨基酸指紋圖譜中色譜峰的藥材歸屬Tab.2 Herb classification of the am ino fingerprin t peaks

2.6 不同批號(hào)清開靈系列制劑的相似度計(jì)算 分別取清開靈注射液 44 批、 軟膠囊 10 批、 膠囊 16批、 顆粒14 批， 樣品按 “1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和 “1.4” 項(xiàng)下衍生化方法制備， 按“1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定， 色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中，按照保留時(shí)間進(jìn)行譜峰匹配后，生成對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算各劑型各廠家各批次與其對(duì)照指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示，各廠家清開靈注射液、軟膠囊、膠囊、顆粒的各批次氨基酸指紋圖譜與各劑型對(duì)照指紋圖譜的相似度值均大于0.90， 其平均值見表3， 說明清開靈系列制劑的 HPLC氨基酸指紋圖譜相似度良好， 表明各制劑的穩(wěn)定性和一致性均良好。

表3 清開靈系列制劑的相似度平均值Tab.3 Average sim ilarity of Qingkailing preparations

2.7 樣品色譜數(shù)據(jù)的系統(tǒng)聚類分析 運(yùn)用 SPSS 軟件，對(duì)所得高效液相指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。將7 個(gè)廠家不同劑型 84 批清開靈系列制劑的 15 個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入 SPSS 軟件，采 用 Ward 法 （Ward's Method）， 利用平方 Euclidean 距離 （Squared Euclidean distance） 作為樣品的測(cè)度進(jìn)行分析。 聚類分析將不同廠家不同劑型樣品分為4類。注射液和其他固體制劑分為兩大類，說明液體制劑和固體制劑的差異較大，與注射液和固體制劑不同的制法相關(guān)。注射液中廠家 D和 F分在第 IV類， 廠家 A、 B、C、 E分在第Ⅲ類; 固體制劑中， 廠家 A生產(chǎn)的膠囊和顆粒分在第Ⅰ類，廠家G生產(chǎn)的膠囊和顆粒，以及廠家B生產(chǎn)的軟膠囊分在第Ⅱ類，說明不同生產(chǎn)廠家對(duì)固體制劑樣品的影響優(yōu)先于不同劑型對(duì)其的影響。根據(jù)圖2聚類分析結(jié)果，在劑型基本一致的前提下，不同廠家的清開靈制劑樣品存在差異，與不同廠家選用的原料藥材來源、生產(chǎn)制備工藝參數(shù)等差異有關(guān)。

圖2 聚類分析Fig.2 Cluster analysis

3 結(jié)論

本研究通過柱前衍生化-HPLC/UV法檢測(cè)氨基酸類成分，建立了清開靈注射液、軟膠囊、膠囊和顆粒的氨基酸色譜指紋圖譜， 并確認(rèn)了其中 15個(gè)共有指紋峰。 對(duì) 7個(gè)廠家 84批清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)和聚類分析，結(jié)果表明各廠家各批次樣品的指紋圖譜相似度較高，質(zhì)量較穩(wěn)定，不同廠家的清開靈系列制劑因生產(chǎn)工藝等差異存在一定的質(zhì)量差異。該方法準(zhǔn)確可靠，實(shí)現(xiàn)了清開靈系列制劑中氨基酸類成分的有效分離和整體評(píng)價(jià)，彌補(bǔ)了清開靈系列制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)板藍(lán)根、水牛角和珍珠母質(zhì)量控制的不足，有利于清開靈系列制劑的全面評(píng)價(jià)。

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Chromatograhpic fingerprint of am ino acids in the Qingkailing preparations

LIU Xiao-xiao1， ZHOU Ying-yi1， YANG Li-wei1， WANG Lei2*

（1.Cuangdong Institute for Food and Drug Control， Cuangzhou 510180， China;2.Collegeof Pharmacy， Jinan University， Cuangzhou 510632， China）

AIM To establish a chromatograhpic fingerprintof amino acids in the Qingkailing preparations， including injections， capsules， soft capsules and granules.METHODS The HPLC analysis of derivatives of preparation with 2，4-dinitro fluorobenzenewas performed on a Venusil AA C18reversed-phase column.Themobile phase consisted of acetonitrile（ phase A） and 0.025mol/L sodium acetate buffer（ pH=6.4）containing 10 mL/L N，N-dimethylformamide（ phase B） in a gradient elution manner.The detection wavelength was set at360 nm.The column temperature was kept at25 ℃ and themobile phase flow rate was1.0 m L/min.RESULTS The amino acids fingerprints of Qingkailing preparations were established and fifteen common peaks were identified as Asp， Glu，Ser，Gly， Thr， Pro， Ala，Val， Met，Cly， Ile， Leu， Try， His/Phe， and Lys.Classification of these amino acids were also attempted.CONCLUSION Themethod can be used to control the quality of BubaliCornu， Margaritifera Concha and Isatidis Radix.

Qingkailing preparations;amino acids;fingerprint

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2537-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.020

2013-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81302654）

劉瀟瀟 （1982—）， 女， 副主任藥師， 理學(xué)博士， 研究方向: 中藥及其制劑分析。 Tel: （ 020） 81886161， E-mail:cpulxx@ 126.com

*通信作者: 王 磊 （1982 —） ， 男， 副研究員， 理學(xué)博士， 研究方向: 天然藥物化學(xué)。 Tel: （020 ） 85223553， E-mail:cpuwanglei@ 126.com