劉瀟瀟, 周穎儀, 楊立偉, 王 磊

（1.廣東省食品藥品檢驗所, 廣東 廣州 510180； 2.暨南大學藥學院, 廣東 廣州 510632）

清開靈系列制劑的氨基酸色譜指紋圖譜

劉瀟瀟1, 周穎儀1, 楊立偉1, 王 磊2*

（1.廣東省食品藥品檢驗所, 廣東 廣州 510180； 2.暨南大學藥學院, 廣東 廣州 510632）

目的 建立清開靈系列制劑 （注射液、 軟膠囊、 膠囊、 顆粒） 的氨基酸色譜指紋圖譜。 方法 樣品與 2，4-二硝基氟苯衍生化反應， Venusil AA色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm， Agela） ， 以乙腈與 N，N-二甲 基甲酰 胺 -0.025 mol/L醋酸鈉 （1 ∶100， 乙酸調(diào) pH6.4） 為流動相， 梯度洗脫， 檢測波長 360 nm， 體積流量 1.0 mL/min， 柱溫 25 ℃。結果 建立了清開靈注射液、 軟膠囊、 膠囊和顆粒等劑型的氨基酸色譜指紋圖譜， 并指認了其中 15 個共有峰 （門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、結氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、 組氨酸、 賴氨酸、 苯丙氨酸）， 并對氨基酸類成分的歸屬進行了探討。 結論 本研究建立的氨基酸色譜指紋圖譜基本能控制清開靈系列制劑中的水牛角、珍珠母及板藍根的內(nèi)在質(zhì)量。

清開靈系列制劑;氨基酸;色譜指紋圖譜

清開靈系列制劑，包括注射液、軟膠囊、膠囊、顆粒，均為國家基本藥物目錄品種，由膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷、水牛角、珍珠母、梔子、板藍根、金銀花八味藥組成，具有清熱解毒，化痰通絡，醒神開竅等功效，主要用于急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、腦出血、急性氣管炎、高熱等病癥［1-6］。 清開靈注射 液來源 于安宮牛黃丸組方， 顆粒和膠囊均為注射液的仿制劑型。近年來，臨床上關于清開靈注射液引起不良反應的報道時有發(fā)生，究其原因之一其現(xiàn)行的質(zhì)量標準不完善，難以有效控制質(zhì)量［7-8］。 注射液和膠囊劑 的現(xiàn)行 標準均 收載于 《 中國藥典》2010 年版一部［1-2］， 顆粒劑的現(xiàn)行標準收 載 于 部 頒 標 準［4-6］， 其 系 列 標 準 中， 對 膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷、梔子、金銀花均有較明確的質(zhì)控指標。板藍根、水牛角和珍珠母均含有豐富的氨基酸類成分［9］，三者總氨基酸約占清開靈注射液總固 體的 20%［10-11］， 但 系列 標 準 中， 僅 通過總氮量的測定來控制氨基酸類成分，顯然這種方法的準確性和專屬性都值得商榷。因此，建立專屬性較強的質(zhì)量評價方法對于水牛角、珍珠母及板藍根的控制非常必要。本實驗利用氨基酸柱前衍生化反應的方 法［12-14］， 建立 了 清 開靈 系 列 制劑 的 氨 基酸類成分指紋圖譜，并對7個生產(chǎn)廠家4種劑型84批樣品進行了色譜指紋圖譜研究分析和比較，同時指認了其中15個共有指紋峰，對其歸屬也進行了探討。本研究建立的氨基酸色譜指紋圖譜基本能控制清開靈系列制劑中的水牛角、珍珠母及板藍根的內(nèi)在質(zhì)量，以期完善該系列制劑的質(zhì)量評價體系，也為進一步探討引起其質(zhì)量差異的原因奠定基礎，以保證該藥的質(zhì)量和臨床療效穩(wěn)定。

1 實驗方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 1100 系列 （ 包括四元泵、 UV檢測器、 柱溫箱、 自動進樣器、 工作站）; Millipore純水儀。 乙腈為色譜純 （ Merck， 德國）;水為純凈水;N，N-二甲基甲酰胺、 醋酸鈉、 2，4-二硝基氟苯、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀均為分析純。

16 種 氨 基酸對照品即門冬氨 酸 （140691-200401）、 谷 氨 酸 （ 140690-200401 ）、 絲 氨 酸（140688-200401 ）、 甘 氨 酸 （ 140689-200401 ）、 蘇氨 酸 （ 140682-200401 ）、 脯 氨 酸 （140677-200405）、 丙 氨 酸 （ 140680-200401 ）、 結 氨 酸（ 140681-200401 ）、 甲 硫 氨 酸 （ 140684-200401 ）、胱氨 酸 （140632-200502 ）、 異 亮 氨 酸 （140683-200401）、 亮 氨 酸 （140687-200401 ）、 色 氨 酸（140686-200401）、 組氨酸 （890-200001）、 賴氨酸（ 140673-200405 ）、 苯 丙 氨 酸 （ 140676-200405 ），均由中國食品藥品檢定研究院提供。清開靈系列制劑分別來源于國內(nèi) 7家生產(chǎn)企業(yè)， 共 84 批， 其中注射液 44 批、 軟膠囊 10 批、 膠囊 16 批、 顆粒14批。

1.2 色 譜 條 件 采 用 Venusil AA （ 250 mm × 4.6 mm， 5 μm） 色譜柱，流動相為乙腈 （A） -N，N-二甲基甲酰胺 -0.025 mol/L醋酸鈉 （1 ∶100，乙酸調(diào) pH 6.4） （B）， 梯度洗脫 10%A→43%A→43%A，相應的時間周期為 0→60 min→70 min），檢測波長為 360 nm; 體積流量 1.0 mL/min; 柱溫25 ℃。 理論塔板數(shù)按亮氨酸峰計， 應不低于5 000。

1.3 溶液的制備

1.3.1 混合對照品溶液 分別精密稱取 16 種氨基酸對照品適量， 加水制成 1 mg/mL的各單標溶液，再分別精密吸取各單標溶液1 m L于20 m L量瓶中，加水制成每 1 mL分別含各氨基酸 0.05 mg的混合對照品溶液，即得。

1.3.2 注射液供試品溶液 將本品混勻， 即得。

1.3.3 口服制劑供試品溶液 取裝量差異項下的本品內(nèi)容物， 混勻， 膠囊和軟膠囊各取約 0.4 g、顆粒劑取約 2.0 g（有糖型）或 1.0 g（無糖型），置具塞錐形瓶中， 精密加水 10 mL， 稱定質(zhì)量， 超聲處理 15 min， 加熱回流 30 min， 取出， 旋搖使分散，放冷，稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，離心15 min， 取上清液濾過，取續(xù)濾液， 即得。

1.4 衍生化反應 分別精密量取對照品溶液與各供試品溶液各 1 mL， 置 25 m L量瓶中， 加入 0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液 2 mL與 1%2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液 1.5 mL，置 60 ℃水浴中放置 90 min， 取出，放冷， 加磷酸鹽緩沖液 （分別取磷酸二氫鉀6.8 g與氫氧化鉀1.36 g混溶于1 000 m L水中， 用磷酸調(diào) pH為7.0， 即得。）稀釋至刻度， 搖勻， 用微孔濾膜濾過，即得。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法、 衍生化反應和色譜條件的優(yōu)化 注射液為水溶液樣品，直接取樣進行衍生化反應后測定。根據(jù)注射液和各口服制劑的處方，以其供試品溶液1 mL與注射液供試品溶液1 mL中板藍根、水牛角和珍珠母的處方量基本一致來調(diào)整確定膠囊、軟膠囊和顆粒的取樣量。樣品提取過程中，比較了超聲、加熱回流等方式，結果表明，僅超聲或加熱回流提取，不能將有效成分完全提出，特別是對于軟膠囊樣品，方法的重復性較差，故最后采用先超聲提取將樣品均勻分散于溶液中，再加熱回流提取的方法，可完全提出有效成分。根據(jù)文獻 ［12-14］， 衍 生 化 反 應 在 60 ℃ 水 浴 中 放 置60 min， 本實驗考察了反應時間 30、 60、 90 min 和衍生化試劑 1%2，4-二硝基氟苯 （DNFB） 的乙腈溶液的加入量 0.5、 1.0、 1.5、 2.0 mL，試驗表明， 反應時間為 60 min 和 90 min 時， 各色譜峰峰面積相當且不再增加。 加入量為 0.5 mL時， 衍生物產(chǎn)率低， 加入量為 2.0 mL時， DNFB副產(chǎn)物 2，4-二硝基苯酚的峰面積太大， 加入量為 1.0 mL和1.5 mL時， 衍生化反應完全且分離效果較理想。故本實驗選用 1%DNFB的乙腈溶液的加入量為1.5 mL，反應時間為 90 min。

由于氨基酸的極性不同，考察了不同的梯度洗脫程序，當初始流動相中乙腈的比例較高時，絲氨酸不易分離;當初始流動相中乙腈的比例較低時，甘氨酸和蘇氨酸的峰形對稱性差，分離度較低?？疾炝瞬煌闹鶞?（22 ℃、25 ℃、28 ℃），柱溫較高時，異亮氨酸與亮氨酸不能有效分離?？疾炝瞬煌?pH （6.2、 6.4、 6.6、 6.8）， pH較低時， 甘氨酸和蘇氨酸、 丙氨酸與脯氨酸分離度較低;pH較高時，賴氨酸色譜峰拖尾嚴重。

2.2 指紋圖譜方法學驗證 本實驗對 7 個生產(chǎn)企業(yè)的清開靈系列制劑 84批樣品進行了對比測定。經(jīng)對比確定 15 個峰為各批供試品共有 （色譜峰1 ～15），且峰面積較為穩(wěn)定，定為共有指紋峰。按 “1.3” 項下供試品溶液的制備和 “1.4” 項下衍生化反應，分別平行配制5份清開靈注射液、軟膠囊、 膠囊和顆粒的供試品溶液， 按 “1.2” 項下色譜條件測定，以指紋峰的保留時間和峰面積為指標計算 RSD， 考察方法的重復性; 同一供試品溶液，連續(xù)進樣5次，以指紋峰的保留時間和峰面積為指標計算 RSD， 考察儀器的精密度; 取供試品溶液， 在 12 h之內(nèi)不同時間連續(xù)進樣檢測， 以指紋峰的保留時間和峰面積為指標計算 RSD， 考察方法的穩(wěn)定性。重復性、精密度和穩(wěn)定性結果見表1。 結果表明，清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜測定方法具有可信的精密度和重復性， 在 12 h內(nèi)樣品穩(wěn)定，可以獲得可靠的指紋圖譜。

表1 指紋圖譜的方法學驗證Tab.1 Evaluation of the fingerprin tm ethod

2.3 專屬性考察 精密量取水 1 mL，置 25 mL量瓶中， 按 “1.4” 項下進行衍生化反應， 得空白供試品溶液， 按 “1.2” 項下色譜條件測定。 結果表明， 保留時間 16.8 min 處的色譜峰為 2，4-二硝基苯酚［12］，計算指紋圖譜相似度時扣 除該色 譜峰。處方中的其他化學成分、輔料及衍生化試劑對測定均無干擾 （見圖 1）。

2.4 色譜峰的指認 通過比較 16 個氨基酸對照品的色譜保留時間，對清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜中的絕大多數(shù)色譜峰進行了指認。其中，脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、結氨酸、亮氨酸、門冬氨酸的峰面積較高，與文獻 ［9-10］ 報道的清開靈注射液中氨基酸的測定結果較一致，說明使用不同的柱前衍生化試劑 （ 異硫氰酸苯酯［9］、 鄰苯二甲醛和9-芴甲基氯甲酸酯［10］） 均能使清開靈注射液中的氨基酸完全衍生化，得到較準確的結果。本實驗在此基礎上，將柱前衍生化法應用于清開靈系列其他固體制劑，結果表明該法結果準確可靠，可用于清開靈其他制劑的氨基酸指紋圖譜的建立和應用。另外，組氨酸 （His）和苯丙氨酸 （Phe） 的保留時間相同。

圖1 氨基酸混合對照品溶液 （A）、 清開靈注射液 （B）、清開靈膠囊 （C）、 清開靈顆粒 （D）、 清開靈軟膠囊 （E） 和空白溶液 （F） 的 HPLC氨基酸指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerp rint of am ino acids reference solution（A） ， Qingkailing In jection （ B）， Q ingkailing Capsules（ C） ， Qingkailing Granules（ D） ， Qingkailing Soft Capsules（ E） and b lank solution（ F）

2.5 氨基酸成分歸屬的探討 為明確清開靈系列制劑氨基酸指紋圖譜中鑒定色譜峰的藥材歸屬，將成品指紋圖譜與板藍根、水牛角、珍珠母中間體的氨基酸色譜圖對照，比較色譜峰的保留時間以及DAD的光譜圖， 確認了這 15 個氨基酸共有指紋峰的來源和歸屬，列于表2中?？梢?，本實驗所得清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜的色譜峰成分基本上來自于板藍板和水牛角水解液。據(jù)報道，珍珠母中也有較 豐富 的 氨 基酸 類 成 分［15-16］， 但本 實 驗 測定的珍珠母中間體的氨基酸色譜圖中色譜峰較少，其原因有待進一步研究。

表2 氨基酸指紋圖譜中色譜峰的藥材歸屬Tab.2 Herb classification of the am ino fingerprin t peaks

2.6 不同批號清開靈系列制劑的相似度計算 分別取清開靈注射液 44 批、 軟膠囊 10 批、 膠囊 16批、 顆粒14 批， 樣品按 “1.3”項下供試品溶液的制備方法和 “1.4” 項下衍生化方法制備， 按“1.2”項下色譜條件測定， 色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)中，按照保留時間進行譜峰匹配后，生成對照指紋圖譜，計算各劑型各廠家各批次與其對照指紋圖譜的相似度。結果顯示，各廠家清開靈注射液、軟膠囊、膠囊、顆粒的各批次氨基酸指紋圖譜與各劑型對照指紋圖譜的相似度值均大于0.90， 其平均值見表3， 說明清開靈系列制劑的 HPLC氨基酸指紋圖譜相似度良好， 表明各制劑的穩(wěn)定性和一致性均良好。

表3 清開靈系列制劑的相似度平均值Tab.3 Average sim ilarity of Qingkailing preparations

2.7 樣品色譜數(shù)據(jù)的系統(tǒng)聚類分析 運用 SPSS 軟件，對所得高效液相指紋圖譜數(shù)據(jù)進行聚類分析。將7 個廠家不同劑型 84 批清開靈系列制劑的 15 個共有峰峰面積導入 SPSS 軟件，采 用 Ward 法 （Ward's Method）， 利用平方 Euclidean 距離 （Squared Euclidean distance） 作為樣品的測度進行分析。 聚類分析將不同廠家不同劑型樣品分為4類。注射液和其他固體制劑分為兩大類，說明液體制劑和固體制劑的差異較大，與注射液和固體制劑不同的制法相關。注射液中廠家 D和 F分在第 IV類， 廠家 A、 B、C、 E分在第Ⅲ類; 固體制劑中， 廠家 A生產(chǎn)的膠囊和顆粒分在第Ⅰ類，廠家G生產(chǎn)的膠囊和顆粒，以及廠家B生產(chǎn)的軟膠囊分在第Ⅱ類，說明不同生產(chǎn)廠家對固體制劑樣品的影響優(yōu)先于不同劑型對其的影響。根據(jù)圖2聚類分析結果，在劑型基本一致的前提下，不同廠家的清開靈制劑樣品存在差異，與不同廠家選用的原料藥材來源、生產(chǎn)制備工藝參數(shù)等差異有關。

圖2 聚類分析Fig.2 Cluster analysis

3 結論

本研究通過柱前衍生化-HPLC/UV法檢測氨基酸類成分，建立了清開靈注射液、軟膠囊、膠囊和顆粒的氨基酸色譜指紋圖譜， 并確認了其中 15個共有指紋峰。 對 7個廠家 84批清開靈系列制劑的氨基酸指紋圖譜進行了相似度評價和聚類分析，結果表明各廠家各批次樣品的指紋圖譜相似度較高，質(zhì)量較穩(wěn)定，不同廠家的清開靈系列制劑因生產(chǎn)工藝等差異存在一定的質(zhì)量差異。該方法準確可靠，實現(xiàn)了清開靈系列制劑中氨基酸類成分的有效分離和整體評價，彌補了清開靈系列制劑現(xiàn)行標準中對板藍根、水牛角和珍珠母質(zhì)量控制的不足，有利于清開靈系列制劑的全面評價。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版第一增補本［S］.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010:229-231.

［ 2 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北 京: 中 國 醫(yī) 藥 科 技 出 版 社， 2010:1107-1109，1112-1113.

［3］ 王 青，曹 進，劉建勛， 等.清開靈指紋圖譜在復方化學配伍中的應用［J］.中成藥， 2009， 31（10）:1485-1487.

［ 4 ］ YBZ06172004， 國家食品藥品監(jiān)督管理局試行標準［S］.

［ 5 ］ WS3-163 （ X-153 ） -99 （ Z） ， WS3-130 （ Z-120 ） -96（Z） -2011， 國家食品藥品監(jiān)督管理局國家標準［S］.

［ 6 ］ 韓 杰.HPLC測定清開靈顆粒中黃芩苷、 梔子苷及膽酸、豬去氧膽酸的含量［J］.中成藥， 2010， 32（2）:227-231.

［7］ 李 榮，蔣英藍，曾敬懷，等.中藥注射劑發(fā)生不良反應的相關性研究進展［J］.中成藥， 2013， 35（5）:1059-1061.

［ 8 ］ 王 燕， 朱丹妮.中藥注射液不良反應溯源［J］.中成藥，2010， 32（7）:1207-1210.

［9］ 蘇建坤.清開靈注射液中氨基酸類成分含量測定方法研究［D］.北京: 北京中醫(yī)藥大學， 2013.

［10］ 李建民， 張 綱， 袁秀志， 等.清開靈注射液生產(chǎn)中板藍根提取液氨基酸分析［ J］.中國現(xiàn)代藥物應用， 2010， 4（22）:8-9.

［11］ 白玉靜， 高曉燕， 張宏桂， 等.HPLC-ELSD法測定清開靈注射液中 19 種氨基酸含量［J］.中國中藥雜志， 2009， 34（24）:3301-3303.

［12］ 付宜和， 楊國慶， 龔道芬， 等.2，4-二硝基氟苯柱前衍生化法測定復方氨基酸注射液 HPLC色譜條件的優(yōu)化［J］.藥物分析雜志， 2005， 25（7）:762-765.

［13］ 李 東， 孫家義.2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法測定 18 種氨基酸［J］.化學分析計量， 2004， 13 （1）: 18-20.

［14］ 張宏杰， 周建軍， 李新生， 等.2， 4-二硝基氟苯衍生法測定游離氨基酸方法的優(yōu)化［ J］.氨基酸和生物資源， 2000，22（4）:59-62.

［15］ 李桂萍.不同品種珍珠母中氨基酸的含量測定［J］.北京中醫(yī)藥大學學報， 1994， 17（1）:60-62.

［16］ 趙希賢， 楊抒寧， 彭 澍.珍珠母水解提取氨基酸工藝的初步研究［ J］.北京中醫(yī)藥大學學 報， 2005， 28 （5）: 54-56.

Chromatograhpic fingerprint of am ino acids in the Qingkailing preparations

LIU Xiao-xiao1， ZHOU Ying-yi1， YANG Li-wei1， WANG Lei2*

（1.Cuangdong Institute for Food and Drug Control， Cuangzhou 510180， China;2.Collegeof Pharmacy， Jinan University， Cuangzhou 510632， China）

AIM To establish a chromatograhpic fingerprintof amino acids in the Qingkailing preparations， including injections， capsules， soft capsules and granules.METHODS The HPLC analysis of derivatives of preparation with 2，4-dinitro fluorobenzenewas performed on a Venusil AA C18reversed-phase column.Themobile phase consisted of acetonitrile（ phase A） and 0.025mol/L sodium acetate buffer（ pH=6.4）containing 10 mL/L N，N-dimethylformamide（ phase B） in a gradient elution manner.The detection wavelength was set at360 nm.The column temperature was kept at25 ℃ and themobile phase flow rate was1.0 m L/min.RESULTS The amino acids fingerprints of Qingkailing preparations were established and fifteen common peaks were identified as Asp， Glu，Ser，Gly， Thr， Pro， Ala，Val， Met，Cly， Ile， Leu， Try， His/Phe， and Lys.Classification of these amino acids were also attempted.CONCLUSION Themethod can be used to control the quality of BubaliCornu， Margaritifera Concha and Isatidis Radix.

Qingkailing preparations;amino acids;fingerprint

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2537-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.020

2013-12-23

國家自然科學基金青年科學基金資助項目 （81302654）

劉瀟瀟 （1982—）， 女， 副主任藥師， 理學博士， 研究方向: 中藥及其制劑分析。 Tel: （ 020） 81886161， E-mail:cpulxx@ 126.com

*通信作者: 王 磊 （1982 —） ， 男， 副研究員， 理學博士， 研究方向: 天然藥物化學。 Tel: （020 ） 85223553， E-mail:cpuwanglei@ 126.com