王鼎峰, 胡 冰, 王荔青

（福建省莆田市藥品檢驗所, 福建 莆田 351100）

HPLC法測定丹燈通腦膠囊中阿魏酸、 丹酚酸 B、 葛根素、 野黃芩苷

王鼎峰, 胡 冰, 王荔青

（福建省莆田市藥品檢驗所, 福建 莆田 351100）

目的 建立 HPLC同時測定丹燈通腦膠囊 （丹參、 燈盞細(xì)辛、 川芎、 葛根） 中阿魏酸、 丹酚酸 B、 葛根素與野黃芩苷的方法。 方法 丹燈通腦膠囊甲醇提取液的測定， 采用島津 LC-2010AHT高效液相色譜儀， 色譜柱為 Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） ， 梯度洗脫、 雙波長檢測 （0 ～10 m in， 250 nm;10 ～35 min， 336 nm）的方法。 結(jié)果 阿魏酸、 丹酚酸 B、 葛根素、 野黃芩苷的線性范圍分別為 3.045 ～60.90 μg/mL（r=0.999 6）、 82.78～1 655.5 μg/mL（r=0.999 7）、 28.64 ～572.80 μg/mL（r=0.999 8） 和 31.725 ～634.50 μg/mL（r=0.999 7）; 平均回收率 （n=9） 分別為 100.2% （RSD為 0.5%）、 100.0% （RSD為 0.7%）、 99.8% （RSD為 0.8%） 和 100.0%（RSD為 0.7%）。 結(jié)論 本方法是對現(xiàn)行的兩個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) （只對其單一組分進行測定） 的改進。

丹燈通腦膠囊;阿魏酸;丹酚酸B;葛根素;野黃芩苷;高效液相色譜法

丹燈通腦膠囊是由丹參、燈盞細(xì)辛、川芎、葛根四味中藥經(jīng)加工提取制成的中藥成方制劑，收載于 《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》［1］和國家食品藥品監(jiān)督管理局局頒藥品標(biāo)準(zhǔn)［2］， 該藥品具有活血化瘀、 祛風(fēng)通絡(luò)之功效。本實驗參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用高效液相色譜法，應(yīng)用梯度洗脫、切換波長等方法，測定該藥品處方中川芎和丹參的有效成分阿魏酸與丹酚酸B，以及葛根和燈盞細(xì)辛的有效成分葛根素與野黃芩苷的量，實驗結(jié)果表明所用方法操作簡便、專屬性好、快捷準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC-2010AHT高效液相色譜儀，UV-VIS 檢測器， LC solution 色譜工作站 （ 日本島津制作所）;UV-2450 型紫外分光光度計 （日本島津制作所）;CPA 224S 型分析天平 （賽多利斯科學(xué)儀器 ［ 北 京］ 有限公司） ;Elmasonic S150 實 驗室應(yīng)用型超聲波清洗器 （ 德國 Elma公司） ;80-2型離心沉淀器 （上海手術(shù)器械廠）。

1.2 試藥 阿魏酸對照品 （批號 110773-201313，純度 99.6%）、 丹酚酸 B對照品 （ 批號 111562-201212， 純 度 95.4%）、 葛 根 素 對 照 品 （ 批 號110752-200912， 純度 96.0%）、 野黃芩苷對照品（批號 110842-200403，純度 97.12%）， 均購自中國食品藥品檢定研究院; 丹燈通腦膠囊 （云南施普瑞生物工程有限公司生產(chǎn)，批號分別為C1713004、 C1713016、 C1713020）; 乙腈、 甲醇為色譜純;磷酸為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法同時測定阿魏酸與丹酚酸 B

2.1.1 色譜條件 以 Thermo Hypersil GOLD （C18）柱為色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）; 甲醇為流動相 A， 0.2%磷酸水溶液為流動相 B， 采用梯度洗脫、 雙波長檢測， 程序見表 1; 體積流量 1.0 mL/min; 柱溫為 25 ℃; 進樣量 10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取阿魏酸、丹酚酸 B對照品適量， 置棕色量瓶中， 加 75%甲醇溶 解， 制成阿魏酸對 照 品 貯 備液 （0.121 8 mg/mL） 和 丹 酚 酸 B 對 照 品 貯 備 液（3.311 mg/mL）。 取上述貯備液各 1 mL至 10 mL棕色量 瓶中， 加 75%甲 醇 定 容， 混 勻， 制成每1 mL含阿 魏 酸 12.18 μg、 丹 酚 酸 B 331.1 μg的 對照品混合溶液。上述溶液均避光、冷藏保存。

表1 梯度洗脫色譜條件Tab.1 Condition of the gradient elution

2.1.3 供試品溶液的制備 取丹燈通腦膠囊 20粒 ， 精密 稱 定， 計 算 ， 其 平 均 裝 量 為 0.361 7 g。將內(nèi)容 物 研 細(xì)、 混 勻 ， 精 密 稱 定 2.277 2 g置 具 塞錐形瓶中， 精密加入75%甲醇50mL， 密塞，稱定質(zhì)量， 超 聲 處 理 1 h （ 功 率 300 W， 頻 率 37 kHz，室溫）， 放冷， 再稱定質(zhì)量， 用 75%甲醇補足減失的 質(zhì)量， 搖勻 ， 離 心 15 min （3 500 r/min） ， 靜置，取上清液， 用 0.45 μm的微孔濾膜過濾， 取濾液，即得。上述溶液均避光、冷處保存。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按該藥品的處方比例和制法，制備不含丹參和川芎的樣品，依照“2.1.3” 項下的方法制備陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗 分別精密吸取上述對照品溶液、 供試品溶液和陰性對照溶液 10 μL， 按上述色譜條件進樣測定，結(jié)果表明陰性樣品在與供試品中阿魏酸、丹酚酸B相同的保留時間處無干擾峰。具體見圖1。

圖1 阿魏酸與丹酚酸B的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of ferulic acid and salvianolic acid B

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取阿魏酸、丹酚酸 B對 照 品 貯 備 溶 液 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、10.0 m L分別置20 m L棕色量瓶中， 加75%甲醇定容， 搖勻。 按上述色譜條件， 分別進樣10 μL進行測定。以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得阿魏酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)為 Y=55 476 783X+41 715， r=0.999 6 （n= 5）; 丹酚酸 B為 Y=12 220 321X+86 821， r= 0.999 7 （ n=5）。 結(jié) 果 表 明阿 魏 酸 在 3.045 ～60.90 μg/mL、 丹酚酸 B在 82.78 ～1 655.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗 取 “2.1.2” 項下對照品混合溶液連續(xù)測定 5 次， 每次進樣 10 μL， 按峰面積計算: 阿魏酸與丹酚酸 B的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）分別為1.3%和 1.5%。 結(jié)果表明精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號 （C1713016） 的供試品溶液， 分別于0、 1、 2、 4、 8、 12、 24 h 進樣10 μL進行測定， 數(shù)據(jù)顯示阿魏酸與丹酚酸 B的峰面積均無明顯變化，按峰面積計算阿魏酸與丹酚酸 B的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 分別為 1.2% 和1.7%。結(jié)果表明樣品在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗 稱取同一批號 （C1713016）樣品 6 份， 按 “2.1.3” 項下方法平行制備供試溶液進行測定，結(jié)果阿魏酸與丹酚酸B的平均含有量的 RSD（n=6）分別為 1.8%和 0.8%。 結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱定已測定含有量的丹燈通腦膠囊 （ 批號 C1713016） 的樣品粉末 9份，分成3組，每組分別精密加入相當(dāng)于樣品中所含阿魏酸與丹酚酸 B量的 80%、 100%、120%的對照品貯備液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率， 結(jié)果見表2。

表 2 阿魏酸、 丹酚酸 B加樣回收率試驗結(jié)果 （n=9）Tab.2 Results of recovery tests for ferulic acid and salvianolic acid B （ n=9）

2.1.11 樣品測定 精密稱定同一生產(chǎn)廠家 3 個不同批號的丹燈通腦膠囊樣品粉末各 3份，按“2.1.3” 項下方法制備供試溶液， 進樣 10 μL進行測定，用外標(biāo)法計算阿魏酸與丹酚酸B量，結(jié)果見表3。

表 3 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.3 Results of determ ination（n=3）

2.2 HPLC法同時測定葛根素與野黃芩苷

2.2.1 色譜條件 以 Thermo Hypersil GOLD （ C18）柱為色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）; 以乙腈-0.1%磷酸水溶液 （16 ∶84） 為流動相， 雙波長檢測（0 ～10 min， 250 nm;10 ～35 min， 336 nm）; 體積流量 1.0 mL/min; 柱溫為 35 ℃; 進樣量 10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取葛根素、野黃芩苷對照品適量，加甲醇溶解，制成葛根素對照品貯備液 （1.145 6 mg/m L） 和野黃芩苷對照品貯備液 （1.269 0 mg/mL）。 取上述對照品貯備液各1 mL置10 m L量瓶中， 加甲醇定容， 混勻， 制成每 1 mL含葛根素 114.56 μg、 野黃芩苷 126.90 μg的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取丹燈通腦膠囊 20粒， 精密稱定， 計算其平均裝量為 0.358 8 g。 將內(nèi)容 物 研 細(xì)、 混 勻， 精 密 稱 定 2.445 1 g， 置100 mL量瓶中， 加 70%甲醇定容， 超聲處理 30 min （功率 300 W， 頻 率 37 kHz， 室 溫）， 冷 卻、靜置， 加 70%甲醇補足至刻度， 搖勻， 離心 20 min （3 500 r/min） 。 精密量取上清液 5 mL， 置 10 mL量瓶中， 加 70%甲醇至刻度， 搖勻， 用 0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按該藥品的處方比例和制法，制備不含葛根和燈盞細(xì)辛的樣品，依照“2.2.3” 項下的方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取上述對照品溶液、 供試品溶液和陰性對照溶液 10 μL， 按上述色譜條件進樣測定，結(jié)果表明陰性樣品在與供試品中葛根素、野黃芩苷相同的保留時間處無干擾峰。具體見圖2。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取葛根素、 野黃芩 苷 對 照 品 貯 備 溶 液 0.5、 1.0、 2.0、 5.0、10.0 mL分別置 20 mL量瓶中， 加甲醇定容， 搖勻。 按上述色譜條件， 分別進樣 10 μL進行測定。以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得葛根素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)為Y=38 952 549X+175 499， r=0.999 8 （n=5）;野黃芩苷為 Y=26 993 729X+112 340， r=0.999 7（n=5 ）。 結(jié) 果 表 明 葛 根 素 在 28.64 ～572.80 μg/mL、 野黃芩苷在 31.725 ～634.50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 葛根素與野黃芩苷的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of puerarin and scutellarin

2.2.7 精密度試驗 取 “2.2.2” 項下對照品混合溶液連續(xù)測定 5 次， 每次進樣 10 μL， 按峰面積計算: 葛根素與野黃芩苷的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）分別為0.7%、0.9%。 結(jié)果表明精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號 （C1713020） 的供試品溶液， 分別于0、 1、 2、 4、 8、 12、 24 h 進樣 10 μL進行測定， 數(shù)據(jù)顯示葛根素與野黃芩苷的峰面積均無明顯變化，按峰面積計算，葛根素與野黃芩苷的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 分別為 0.8%和1.2%。 結(jié)果表明樣品在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 稱取同一批號 （C1713020）樣品 6 份，按 “2.2.3”項下方法平行制備供試溶液進行測定，結(jié)果葛根素與野黃芩苷的平均含有量的 RSD（n=6） 分別為 0.6%和 0.7%。 結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱定已知含有量的丹燈通腦膠囊 （批號 C1713020） 的樣品粉末 9 份，分成3組，每組分別精密加入相當(dāng)于樣品中所含葛根素與野黃芩苷量的 80%、 100%、 120%的對照品貯備液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.2.11 樣品測定 精密稱定同一廠家 3 個不同批號的丹燈通腦膠囊樣品粉末各 3 份，按 “2.2.3”項下方法制備供試溶液， 進樣 10 μL進行測定， 用外標(biāo)法計算葛根素與野黃芩苷的量， 結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 丹燈通腦膠囊現(xiàn)行的兩個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1-2］均只對其單一組分進行質(zhì)量控制，且方法各異，不能全面地反映該藥品的質(zhì)量。本實驗采用高效液相色譜法，應(yīng)用梯度洗脫、雙波長檢測的方法，同時對該藥品有效成分阿魏酸與丹酚酸B、葛根素與野黃芩苷進行定量分析，實驗結(jié)果表明所用方法操作簡便、專屬性好、檢測效率高，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

表 4 葛根素、 野黃芩苷加樣回收率試驗結(jié)果 （n=9）Tab.4 Results of recovery tests for puerarin and scutellarin（n=9）

表 5 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.5 Results of determ ination（n=3）

3.2 參考相關(guān)文獻(xiàn)［3-17］， 采用加熱回 流、 超 聲 提取2種方法對樣品提取結(jié)果進行了考察比較，結(jié)果顯示超聲提取的方法操作簡便、提取效率較好?！?.1” 項選用乙醇、 75%乙醇、 甲醇、 75%甲醇 4種提取溶劑進行考察， “2.2” 項選用乙醇、 70%乙醇、 甲醇、70%甲醇 4 種提取溶劑進行考察， 結(jié)果顯示 “2.1”、 “2.2” 項分別用 75%甲醇和 70%甲醇提取的樣品雜質(zhì)較少、目標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率高，適于相應(yīng)實驗樣品的提取。

3.3 通過紫外分光光度計的掃描， 本實驗 4 個有效成分丹酚酸B、野黃芩苷、阿魏酸、葛根素分別在 286 nm、 335 nm、 321 nm、 250 nm處有最大吸收， 與 《 中國藥典》［3］中丹參、 燈盞細(xì)辛、 川芎、葛根四味中藥有效成分標(biāo)注的檢測波長一致，由此確定了上述有效成分的吸收波長。

3.4 “2.1” 項比較了甲醇-1%冰醋酸水溶液、 甲醇-0.2%磷酸水溶液 2 種流動相系統(tǒng)， 結(jié)果顯示采用甲醇-0.2%磷酸水溶液作為流動相， 待測組分有響應(yīng)值，且出峰時間理想，分離效果和峰形均較好，適于該藥品上述組分的檢測分析。

3.5 “2.2” 項采用同一流動相， 在 250 nm與336 nm波長處各測試了 1 次樣品， 結(jié)果顯示葛根素、野黃芩苷在各自最大吸收波長以外的響應(yīng)值均偏低，不利于檢測分析;后借鑒 《中國藥典》 中多巴絲肼片［18］含量測定項下的雙波長檢測方法，采用在同一流動相下切換波長的檢測方法 （葛根素檢測波長為 250 nm， 待葛根素出峰完全后檢測波長改為336 nm， 以待檢測野黃芩苷）， 結(jié)果顯示該方法操作簡便、分離效果好，適于該藥品上述組分的檢測分析。

［1］ 國家藥品監(jiān)督管理局.國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編: 經(jīng)絡(luò)肢體、腦系分冊［S］.2002:254-257.

［ 2 ］ 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn) （試行） WS-10751 （ ZD-0751） -2002-2011Z［ S］.2011.

［ 3 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北 京: 中 國 醫(yī) 藥 科 技 出 版 社， 2010:38， 70-71，138， 312-313.

［ 4 ］ 何 洋， 王冬梅， 董振敏， 等.HPLC法同時測定丹燈通腦膠囊中野黃芩苷和丹酚酸 B的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報， 2007， 24（8）:491-494.

［ 5 ］ 李曉莉， 李曉蓉， 王麗娟， 等.RP-HPLC測定丹芎方中丹參素、 阿魏酸、 隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量［J］.中成藥， 2008， 30（1）:77-80.

［ 6 ］ 劉亞英， 梁 敏， 杜艷玲， 等.HPLC法同時測定注射用冠心寧中原兒茶醛、 阿魏酸、 丹酚酸 B的含量［J］.中國藥師， 2011， 14（10）:1469-1471.

［7］ 肖鳳霞， 王鳳云，符惠燕.高效液相色譜法測定益心片中阿魏酸與丹酚酸 B的含量［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005， 22（4）:304-306.

［8］ 張 嫻， 徐英宏.乳腺增生丸中6種有效成分含量測定［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報， 2013， 32（11）:1507-1509.

［ 9 ］ 欒 爽， 王冬梅， 趙懷清， 等.HPLC同時測定心腦聯(lián)通膠囊中葛根素、 虎杖苷和野黃芩苷的含量［J］.中國藥學(xué)雜志， 2008， 43（19）:1510-1512.

［10］ 邱 穎.RP-HPLC法測定丹燈通腦軟膠囊中葛根素和阿魏酸的含量［J］.安徽醫(yī)藥， 2013， 17（2）:212-213.

［11］ 徐嘉成， 江雪平， 陳科力.丹燈通腦片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［ J］ .湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2007， 9（1） :49-51.

［12］ 程夏倩， 張文婷， 程維明， 等.RP-HPLC法同時測定冠脈寧片中葛根素和丹酚酸 B［ J］.中成藥， 2012， 34 （12）: 2355-2358.

［13］ 金藝淑， 何 群， 王凈凈， 等.眩暈定顆粒中葛根素和阿魏酸的 HPLC測定及水提工藝［ J］.中國藥師， 2009， 12（11）:1540-1542.

［14］ 杜志茂， 黃安軍， 白 娟.HPLC法同時測定消栓通絡(luò)膠囊中阿魏酸、 蘆丁和丹酚酸 B的含量［J］.中國藥事，2010， 24（7）:693-695.

［15］ 陳 斌， 葉 雋， 紀(jì) 峰， 等.高效液相色譜法同時測定腦血栓片中丹參素、原兒茶醛、芍藥苷、阿魏酸和丹酚酸B的含量［ J］ .藥物分析雜志， 2007， 27（12） :1891-1894.

［16］ 王麗芳.樂脈分散片中 3 種活性成分的溶出度比較［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志， 2013， 19（19）:50-53.

［17］ 張 樂， 張 強， 劉 娟， 等.參七消痞顆粒中野黃芩苷和丹酚酸 B含量測定方法研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013， 36（8）:550-553.

［18］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版二部［S］.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010:704-705.

Sim ultanous determ ination of ferulic acid， salvianolic acid B， puerarin and scutellarin in Dandeng Tongnao Capsules by HPLC

WANG Ding-feng， HU Bing， WANG Li-qing

（ Fujian Putian Institute for Drug Control， Putian 351100， China）

AIM To develop an HPLCmethod for simultaneously determining the contents of ferulic acid and salvianolic acid B， puerarin and scutellarin in Dandeng Tongnao Capsules（ SalviaeMiltiorrhizae Radix et Rhizoma，Erigerontic Herba， Chuanxiong Rhizoma， Puerariae Lobatae Radix） .METHODS The analyticalmethod was established using SHIMADZU LC-2010AHTHPLC system.The HPLC column used in this studywas Thermo Hypersil GOLD （ C18） column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） in a gradient elution mode with dual wavelength detection（0-10 min， 250 nm;10-35 min， 336 nm） .RESULTS The linearity ranges obtained from the calibration curves of ferulic acid， salvianolic acid B， puerarin and scutellarin were 3.045-60.90 μg/mL（ r=0.999 6 ） ，82.78-1 655.5 μg/mL（r=0.999 7），28.64-572.80 μg/mL（r=0.999 8）， 31.725-634.50 μg/mL（r= 0.999 7） ， respectively.The average recoveries and RSD （ n=9 ） were 100.2% （ RSD of 0.5%） ， 100.0%（ RSD of0.7%）， 99.8% （ RSD of0.8%）， and 100.0% （RSD of0.7%）， respestively.CONCLUSION This method is an improvementof two current standards， which only concentrateson themeasurement of one constituent.

Dandeng Tongnao Capsules;ferulic acid;salvianolic acid B;puerarin;scutellarin;HPLC

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2532-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.019

2014-02-18

王鼎峰 （1977—）， 男， 副主任藥師， 從事藥品檢驗和質(zhì)量研究。 Tel:18059552158， （0594 ） 2601069， E-mail:wd f0594@ 163.com