汪 芳, 林 吉*, 鄧麗紅, 朱 莉, 賴小平, 張 軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開(kāi)發(fā)研究中心, 廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006）

[質(zhì) 量]

HPLC法同時(shí)測(cè)定加味穿心蓮散中 6種成分

汪 芳1, 林 吉1*, 鄧麗紅1, 朱 莉2, 賴小平1, 張 軍1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開(kāi)發(fā)研究中心, 廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006）

目的 建立同時(shí)測(cè)定加味穿心蓮散 （穿心蓮、木香、厚樸、蒼術(shù)和干姜） 中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、 去氫木香內(nèi)酯、 和厚樸酚及厚樸酚的高效液相色譜方法。 方法 加味穿心蓮散甲醇提取液采用 Diamonsil C18（5 μm， 250mm ×4.6 mm） 色譜柱分離; 甲醇-水梯度洗脫， 體積流量為 1.0mL/min; 穿心蓮內(nèi)酯、 木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、 和厚樸酚及厚樸酚檢測(cè)波長(zhǎng)均為 225 nm， 脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm， 進(jìn)樣量為10 μL。 結(jié)果上述 6 種成分在 50min 內(nèi)即達(dá)到基線分離， 且分別在 0.046 8 ～0.936 0 μg（r=0.999 99）、 0.051 0 ～1.020 μg（r= 0.999 99）、 0.101 3 ～2.026 μg（ r=0.999 95）、 0.154 1 ～3.081 μg（ r=0.999 96）、 0.050 9 ～1.018 μg（ r= 0.999 98）、 0.116 3 ～2.325 μg（r=0.999 61） 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系， 各成分的平均加樣回收率在99.3% ～104.0%之間， RSD小于 3%。 結(jié)論 本方法簡(jiǎn)單， 精確， 可重復(fù)， 并對(duì)加味穿心蓮散改制成顆粒劑提供質(zhì)量評(píng)價(jià)。

加味穿心蓮散;穿心蓮內(nèi)酯;脫水穿心蓮內(nèi)酯;木香烴內(nèi)酯;去氫木香內(nèi)酯;和厚樸酚;厚樸酚

加味穿心蓮散是由穿心蓮、木香、厚樸、蒼術(shù)和干姜等五味藥材粉末制成的散劑，具有清熱解毒、理氣和中、除濕化滯的功效，主要用于治療瀉痢、積滯等腸道疾病。處方中穿心蓮、木香和厚樸是起主要功效的藥材，多含有熱不穩(wěn)定性成分和揮發(fā)油類成分，如:穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯在加熱過(guò)程中容易脫水轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯，并且加熱也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)破壞， 使兩者的總量下降［1］;木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為木香揮發(fā)油的主要成分， 也是木香的主要活性成分［2］， 在儲(chǔ)藏過(guò)程中易損失，使藥效降低;厚樸主要含有酚類和揮發(fā)油類，其中厚樸酚及和厚樸酚為厚樸的主要活性成分，但這2種成分在炮制過(guò)程中均易損失，造成市售商品質(zhì)量參 差不齊［3-4］。 為了 有效地 控制產(chǎn) 品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)處方中的穿心蓮、木香和厚樸中的主要成分進(jìn)行測(cè)定研究，為評(píng)價(jià)和控制該制劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC-20A高效液相色譜儀 （SPD-20A UV-VIS 檢測(cè)器， LC-20AT泵， SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器， Labsolution 色譜工作站）; 十萬(wàn)分之一分析天平 （ 美 國(guó) Mettler Toledo CP225D） ; 萬(wàn)分 之 一 分析 天 平 （ 美 國(guó) Mettler Toledo AB204-N）;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器 （江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品 （110797-201108），脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品 （110854-201007）， 木香烴內(nèi)酯對(duì)照品 （111524-201208）， 去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品 （ 111525-201008 ）， 厚 樸 酚 對(duì) 照 品 （ 110729-200412）， 和厚樸酚對(duì)照品 （110730-201112）， 均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院; 蒼術(shù) （產(chǎn)地江蘇，批號(hào) 110801）， 干姜 （產(chǎn)地江蘇， 批號(hào) 111102），木香 （產(chǎn)地云南， 批號(hào) 130601）， 厚樸 （產(chǎn)地云南， 批號(hào)130501），均購(gòu)于大翔制藥有限公司; 穿心蓮 （產(chǎn)地廣西， 批號(hào) 11040250）， 購(gòu)于華濟(jì)中藥飲片有限公司。水為超純水;其余試劑為分析純。加味穿心蓮散由華南生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為 20140105、 20140106、 20140107。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 經(jīng)優(yōu)選色譜條件， 確定固定相為Diamonsil C18色譜柱 （5 μm， 250 mm ×4.6 mm）;流動(dòng)相為甲醇-水，按表 1 梯度洗脫; 穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚及厚樸酚檢測(cè)波長(zhǎng)均為 225 nm， 脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm; 體積流量 1.0 m L/min; 進(jìn)樣量 10 μL。 在該色譜條件下，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚及厚樸酚能達(dá)到基線分離， 其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾， 見(jiàn)圖1。

表 1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution of mobile phase

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯、 脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚、厚樸酚對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每 1 mL含穿心蓮內(nèi)酯 0.468 mg、 脫水穿心蓮內(nèi)酯 0.510 mg、 木香烴內(nèi)酯 1.013 mg、 去氫木香內(nèi)酯 1.541 mg、 和 厚 樸 酚 0.509 mg及 厚 樸 酚1.163 mg的對(duì)照品溶液。 再精密量取以上對(duì)照品溶液各 1 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含穿心蓮內(nèi)酯 0.046 8 mg、 脫水穿心蓮內(nèi)酯0.051 0 mg、 木香烴內(nèi)酯 0.101 3 mg、 去氫木香內(nèi)酯 0.154 1 mg、 和厚樸酚 0.050 9 mg及厚樸酚0.116 3 mg的混合對(duì)照品溶液， 搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約3 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 精密加入甲醇 50 m L， 稱定質(zhì)量， 超聲處理 （功率 360 W， 頻率 40 kHz）30 min， 放冷， 再稱定質(zhì)量， 用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方分別制備除去穿心蓮藥材、木香藥材、厚樸藥材的陰性樣品，按照 “2.3” 項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液 1、2、 6、 10、 15、 20 μL， 按 “2.1” 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo) （Y）， 對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X）， 分別進(jìn)行線性回歸， 得到的回歸方程及相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)， 見(jiàn)表2。 結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯在 0.046 8 ～0.936 0 μg、 脫水穿心蓮內(nèi)酯在 0.051 0 ～1.020 μg， 木香烴內(nèi)酯在 0.101 3 ～2.026 μg、 去氫木香內(nèi)酯在 0.154 1 ～3.081 μg、 和厚樸酚在 0.050 9 ～1.018 μg、 厚樸酚在 0.116 3 ～2.325 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s

表2 各對(duì)照品的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Regression equation and correlation coefficient of reference substances

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL， 按照 “2.1” 項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定， 連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各色譜峰的峰面積，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的 RSD值分別為 0.5%、0.4%、 0.2%、 0.3%、 0.2%、 0.1%， 結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品粉末約3.0 g， 精密稱定6 份，按照 “2.3” 項(xiàng)下的方法分別制備供試品溶液， 按照 “2.1” 項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得樣品中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚、厚樸酚的平均 含 有 量 的 RSD 值 分 別 為 1.0%、1.1%、0.6%、 1.0%、 0.8%、 0.4%， 結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液， 按照 “2.1” 項(xiàng)下的色譜條件分別在 0、 1、 2、 4、 8、24 h進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得樣品中穿心蓮內(nèi)酯、 脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚、厚樸 酚 的 量 的 RSD 值 分 別 為 0.7%、0.5%、0.5%、0.2%、 0.6%、 0.4%， 結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含有量的加味穿心蓮散 6 份，每份約 1.5 g， 精密稱定， 分別精密加入穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液 1.20 m L、 脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液 1.50 mL、 木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液 2.00 mL、 去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品溶液 4.50mL、和厚樸酚對(duì)照品溶液3.20 m L及厚樸酚對(duì)照品溶液3.00 m L， 用甲醇補(bǔ)足至 50 m L， 再按照 “2.3” 項(xiàng)下的制備方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3～8。

表3 穿心蓮內(nèi)酯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for andrographolide

表4 脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests for didehydroand rographolide

表5 木香烴內(nèi)酯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests for costunolide

表6 去氫木香內(nèi)酯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of recovery tests for dehydrocostuslactone

表7 和厚樸酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of recovery tests for honokiol

表8 厚樸酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Results of recovery tests for m agnolol

2.10 樣品測(cè)定 取3 批加味穿心蓮散樣品，按照“2.3” 項(xiàng)下的方法制備供試品溶液， 各吸取 10 μL注入液相色譜儀中， 按照 “2.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分別計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚和厚樸酚的總量，結(jié)果見(jiàn)表9。

表 9 樣品測(cè)定結(jié)果 （n=3）Tab.9 Determ ination resu lts of samples（ n=3）

3 討論

本處方中的穿心蓮、木香、厚樸分別為清熱解毒藥、行氣藥、芳香化濕藥，三者均具有一定的抗炎、抗腹瀉作用。如臨床使用穿心蓮注射液治療仔豬白痢病和胃腸炎等癥， 療效顯著［5］， 并且研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可有效緩解番瀉葉和蓖麻油所致小鼠的腹瀉［6］。 亦有文獻(xiàn)報(bào)道， 木香可減少蓖麻油引起的小鼠小腸性腹瀉和番瀉葉引起的小鼠大腸性腹瀉次數(shù)，對(duì)小鼠墨汁胃腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)也有弱的抑制作用［7-8］。 而厚樸醇提物 只可對(duì) 抗番瀉 葉性小 鼠腹瀉， 對(duì)蓖麻油性腹瀉無(wú)明顯影響［9］。 此外，厚樸酚及和厚樸酚為厚樸的主要有效成分，其主要功效為抗腹瀉作用，有文獻(xiàn)表明厚樸酚及和厚樸酚可明顯抑制番瀉葉性小鼠腹瀉［10-11］。

本實(shí)驗(yàn)建立了加味穿心蓮散的穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、和厚樸酚、厚樸酚的定量測(cè)定方法，對(duì)加味穿心蓮散的6個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行了提取方式、溶媒種類、溶媒用量、提取時(shí)間的考察。在提取方式 （回流、超聲）考察中，2種提取方式的結(jié)果相差不大，為了提取方便， 選擇超 聲 提 取; 溶 媒 種 類 （40% 甲醇、70%甲醇、 甲醇） 考察中， 結(jié)果顯示直接用甲醇提取，各指標(biāo)成分的提取率最大; 溶媒用量 （25、50、 75、 100 mL） 和提取時(shí)間 （20、 30、 40、 60 min） 考察中， 各指標(biāo)成分的提取得率差異不大，考慮樣品或飲片可能出現(xiàn)的波動(dòng)及方法適用性，確定溶媒用量為 50 mL， 提取時(shí)間為 30 min。 本方法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、重復(fù)性好，同時(shí)測(cè)定加味穿心蓮散中6種藥效成分的量，具有實(shí)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)參考 《中國(guó)藥典》 中穿心蓮、木香、厚樸的成分定量測(cè)定［12］， 對(duì)色譜柱、 流動(dòng)相、 體積流量及檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選，并對(duì)梯度洗脫時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。 此外， 《中國(guó)藥典》 2010 年版中穿心蓮、木香、厚樸這三味藥材的成分定量測(cè)定分別是以穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚與和厚樸酚的總量計(jì)的，所以本實(shí)驗(yàn)樣品的測(cè)定結(jié)果也選擇以三類成分的總量計(jì)。本實(shí)驗(yàn)所建立的加味穿心蓮散的成分定量測(cè)定方法，為加味穿心蓮散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供了科學(xué)依據(jù)，并為后續(xù)顆粒劑的工藝研究奠定了基礎(chǔ)。

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Sim ultaneous determ ination of six constituents in JiaweiChuanxinlian Pow der by HPLC

WANG Fang1， LIN Ji1*， DENG Li-hong1， ZHU Li2， LAIXiao-ping1， ZHANG Jun1

（1.Development&Research Center of New Chinese Drugs， Cuangzhou University of ChineseMedicine， Cuangzhou 510006， China;2.Cuangdong Medicine College， Cuangzhou 510006， China）

AIM To establish an HPLCmethod for simultaneously determining six constituents（ andrographolide， didehydroandrographolide， costunolide，dehydrocostuslactone，honokiol and magnolol） in Jiawei Chuanxinlian Powder（ Andrographitis Herba， Aucklandiae Radix， Magnoliae officinalis Cortex， Atractylodis Rhizoma， Zingiberis Rhizoma）.METHODS The separation was performed on Diamonsil C18（5 μm， 250 mm ×4.6 mm）column withmobile phase consisted ofmethanol-waterwith flow rate of1.0mL/min in gradientelutionmode.The detection wavelength was setat225 nm and 254 nm， respectively.RESULTS Six constituents could bewell separated at baseline in 50 min.The linearity ranges of six constituentswere 0.046 8 ～0.936 0 μg， 0.051 0 ～1.020 μg， 0.1013 ～2.026 μg， 0.154 1 ～3.081 μg， 0.050 9 ～1.018 μg， and 0.1163 ～2.325 μg， respectively.The correlation coefficients of them were0.999 99， 0.999 99， 0.999 95，0.999 96， 0.999 98 and 0.999 61，respectively.The average recovery ranged from 99.3%to 104.0%with RSD less than 3%.CONCLUSION The establishedmethod is simple， accurate， reproducible， and can be used for the quality assessment of Jiawei Chuanxinlian Powder prosessed into granules.

Jiawei Chuanxinlian Powder;andrographolide;didehydroandrographolide;costunolide;dehydrocostuslactone;honokiol;magnolol

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2521-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.017

2014-03-17

國(guó)家科技部 “十二五” 國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題 （2011BAI01B01）

汪 芳 （1988—）， 女， 碩士生， 主要從事復(fù)方中藥新藥研究與開(kāi)發(fā)。 Tel: （020） 39358519， E-mail:wflzc101@163.com

*通信作者: 林 吉， 男， 研究員， 碩士生導(dǎo)師， 主要從事復(fù)方中藥新藥研究與開(kāi)發(fā)。 E-mail:LinJi886@163.com