韓姍姍, 李 輝, 黨翔吉, 牛倩倩, 陳夢(mèng)鈺, 焦海勝

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部, 甘肅 蘭州 730030）

銀屑片治療小鼠銀屑病的實(shí)驗(yàn)研究

韓姍姍1, 李 輝1, 黨翔吉1, 牛倩倩1, 陳夢(mèng)鈺1, 焦海勝2*

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部, 甘肅 蘭州 730030）

目的 考察銀屑片 （萆薢、 當(dāng)歸、 紅花、 梔子等） 對(duì)銀屑病樣小鼠模型的治療作用。 方法 采用咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型及鼠尾鱗片顆粒層模型，觀察銀屑片對(duì)皮損形態(tài)學(xué)變化及對(duì)表皮顆粒層形成的影響。結(jié)果 咪喹莫特模型組小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、皮膚增厚現(xiàn)象，皮損組織表現(xiàn)為棘層增厚、角化不全。與模型組相比，銀屑片各劑量組小鼠銀屑病樣皮損癥狀減輕， 銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度 （PASI） 評(píng)分降低， 角化不全和表皮增厚現(xiàn)象得到改善， 增殖細(xì)胞核抗原 （PCNA） 的表達(dá)有所降低。 與正常對(duì)照組相比， 銀屑片各劑量組對(duì)小鼠鼠尾鱗片顆粒層的形成有促進(jìn)作用。結(jié)論 銀屑片對(duì)上述小鼠銀屑病模型具有一定的治療作用。

銀屑片;銀屑病;小鼠

銀屑病是一種常見且易復(fù)發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，也是一種多基因遺傳背景下發(fā)生的由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病［1-3］。 銀屑病 的基本 病理特點(diǎn)為表皮細(xì)胞過度 增 殖 和角化不全。 咪 喹 莫特 （ imiquimod， IMQ） 是 Toll樣受體 （ Toll-like receptor，TLR） -7/8 的免疫激活劑［4］， 可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)銀屑病樣皮損癥狀和 組織學(xué) 改變［5-8］。 成 年小鼠尾部鱗片表皮呈不全角化，類似銀屑病角化不全病理生理改變。銀屑片由萆薢、當(dāng)歸、紅花、梔子等中藥制成，具有瀉火除煩、清熱涼血、活血驅(qū)風(fēng)等功能， 臨床用于銀屑病的治療取得滿意療效［9-10］。 本實(shí)驗(yàn)采用咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠皮膚銀屑病樣皮損模型和鼠尾鱗片顆粒層模型，觀察銀屑片的療效，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠， 體質(zhì)量 （20 ± 2） g， 由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證書號(hào):SCXK（甘） 200806。

1.2 藥品與試劑 銀屑片 （蘭州大學(xué)第二醫(yī)院制劑室， 批號(hào) 20130426）; 雷公藤多苷片 （安徽新隴海藥業(yè)有限公司產(chǎn)品， 批號(hào) 130201）;5%咪喹莫特乳膏 （湖北科益藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品， 批號(hào)130303）; 兔抗增殖細(xì)胞核抗原 （PCNA） 多克隆抗體 （武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）; 兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒 SP-9001 （北京中杉金喬生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 GTZA型精密電子天平;BX-50 奧林巴斯顯微鏡;切片機(jī);自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī);包埋機(jī);病理組織漂烘機(jī)。

2 方法與分組

2.1 咪喹莫特模型分組 取 48 只昆明種小鼠背部除毛后單籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，模型組，銀屑片高、中、低劑量組和雷公藤多苷陽性藥物對(duì)照組。 各組小鼠 （除正常對(duì)照組） 背部每日涂抹 5%咪喹莫特乳膏 42 mg， 同時(shí)灌胃給藥，每天2次，連續(xù)8 d: 正常對(duì)照組與模型組給予等容積生理鹽水;中劑量的選擇按照不同種屬動(dòng)物間等效劑量的直接折算公式計(jì)算，高、中、低劑量選擇4 ∶2 ∶1 的比例， 則銀屑片高、 中、 低劑量組分別給予銀屑片溶液 0.68 g生藥/（kg·d）、 0.34 g生藥/（kg·d）、 0.17 g生藥/（kg·d）; 雷公藤多苷片 組給予雷公藤 多苷片 溶液 0.094 g生藥/（kg·d）。

2.2 鼠尾鱗片顆粒層模型分組 正常小鼠尾部鱗片表皮天然缺少顆粒層，類似人類銀屑病表皮分化障礙的病理改變，故采用此模型來評(píng)價(jià)藥物促進(jìn)顆粒層形成的作用。 取昆明種小鼠 40 只， 隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組，銀屑片高、中、低劑量組，雷公藤多苷片組，每組8只。正常對(duì)照組給予等容積生理鹽水，銀屑片高、中、低劑量組分別給藥 0.68 g生藥/（kg·d）、 0.34 g生藥/（kg·d）、0.17 g生藥/（kg·d），雷公藤多苷片組 0.094 g生藥/（kg·d）。 每天 2 次， 連續(xù)灌胃 21 d。

3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

3.1 咪喹莫特模型檢測(cè)指標(biāo)［11]

3.1.1 小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度（psoriasis area and severity index， PASI） 評(píng)分［5-6］觀察各組小鼠每天的皮損變化情況， 依據(jù) PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 給 予 小 鼠 皮 損 處 紅 斑 （ erythema） 、 鱗 屑（scales）和浸潤(rùn)增厚程度 （ thickness） 0 ～4 的積分:0， 無;1， 輕度;2， 中度;3，重度;4， 極重度。 將三者積分相加得到總積分 （0 ～12）， 對(duì)各組小鼠積分取平均值后繪制趨勢(shì)線。

3.1.2 小鼠背部皮損病理學(xué)改變 采用蘇木精-伊紅 （HE） 染色觀察。剪取各組小鼠背部皮損皮膚固定于4%多聚甲醛， 經(jīng)脫水、 石蠟包埋、 切片、HE染色后觀察皮膚病理學(xué)改變， 并測(cè)量表皮厚度。

3.1.3 小鼠背部皮損 PCNA的表達(dá) 剪取各組小鼠背部皮損皮膚，進(jìn)行包埋，石蠟切片經(jīng)抗原熱修復(fù)、 抗體孵育、 DAB顯色、 蘇木精復(fù)染， 同步設(shè)立陰性對(duì)照。

3.2 鼠尾鱗片顆粒層模型檢測(cè)指標(biāo)

3.2.1 鼠尾鱗片顆粒層形成情況 末次給藥 24 h后處死小鼠， 在距尾根部約 2 cm處取背面皮膚一長(zhǎng)條 （1.5 cm×0.2 cm）， 4%多聚甲醛固定， 石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察鼠尾鱗片顆粒層形成， 計(jì)數(shù)連續(xù)100 個(gè)鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)，并對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （）， 組間比較采用單因素方差分析方法， 以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1 咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型皮損的形態(tài)學(xué)變化 圖1可見，與正常對(duì)照組相比，咪喹莫特模型組在咪喹莫特涂抹1～2 d后皮膚即出現(xiàn)紅斑、 鱗屑及皮膚增厚現(xiàn)象，皮損癥狀在7～8 d最為嚴(yán)重，呈典型的銀屑病樣改變。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，模型組皮損日益嚴(yán)重:紅斑由少量淡粉色斑點(diǎn)變?yōu)榇竺娣e深紅偏棕褐色斑塊;鱗屑由瑣碎狀增多增厚，過渡至布滿裸露皮膚的層狀鱗屑;皮膚逐漸褶皺、隆起，增厚浸潤(rùn)明顯。銀屑片高、中、低劑量組和雷公藤多苷組皮損癥狀與模型組相比明顯減輕，鱗屑較少，紅斑量少且色淺，增厚浸潤(rùn)程度較輕。

5.2 銀屑片對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型皮損的病理學(xué)變化的影響 HE染色顯示:正常對(duì)照組小鼠皮膚可見菲薄的角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層;咪喹莫特模型組小鼠皮膚過度角化、角化不全、棘層肥厚;銀屑片高、中、低劑量組小鼠皮膚角化過度減輕、棘層變薄，表皮層厚度明顯低于模型組， 見圖2。 通過測(cè)量表皮層厚度發(fā)現(xiàn): 模型組小鼠表皮層增厚明顯，銀屑片組表皮層增厚程度低，與模型組比較有顯著差異 （P＜0.05）， 見表1。

圖1 各組小鼠皮損積分趨勢(shì)Fig.1 PASI scores of mouse skin lesions induced by im iquimod

表1 各組小鼠治療8 d皮損處表皮層厚度的比較 （，n=8）Tab.1 Com parison of epiderm is thickness in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

表1 各組小鼠治療8 d皮損處表皮層厚度的比較 （，n=8）Tab.1 Com parison of epiderm is thickness in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

注: 與模型組比較，*P＜0.05

組別 給藥 劑量 /（ g·kg-1·d-1） 表 皮層厚 度 /μm正常組 生理鹽水 9.21 ±1.32*模型組 生理鹽水 82.37 ±11.05銀屑片高劑量組 0.68 40.40 ±5.77*銀屑片中劑量組 0.34 53.39 ±10.15*銀屑片低劑量組 0.17 59.34 ±9.87*雷公藤多苷片組 0.094 38.80 ±7.59*

5.3 銀屑片對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型皮損 PCNA的表達(dá)的影響 正常對(duì)照組小鼠PCNA陽性表達(dá)僅限于表皮基底層， 呈線狀排列;咪喹莫特模型組陽性細(xì)胞不僅局限于基底層，表皮中下層也有表達(dá)，著色細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯增多;銀屑片高、中、低劑量組著色細(xì)胞層數(shù)較模型組少，見圖3。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 與模型組比較銀屑片組 PCNA表達(dá)顯著降低 （P＜0.05）， 見表 2。

圖 3 各組小鼠治療 8 d皮損處 PCNA的表達(dá) （ ×400）Fig.3 PCNA expression of skin lesions at day 8 of treatment（ imm unohistochem ical staining， ×400）

表2 各組小鼠治療8 d皮損處 PCNA的表達(dá) （， n=8）Tab.2 Expression of PCNA in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

表2 各組小鼠治療8 d皮損處 PCNA的表達(dá) （， n=8）Tab.2 Expression of PCNA in skin lesions at day 8 of treatment（， n=8）

注: 與模型組比較，*P＜0.05

組別 給藥 劑量 /（ g·kg-1·d-1） PCNA/%正常組 生理鹽水 4.62 ±1.51*模型組 生理鹽水 11.88 ±3.87銀屑片高劑量組 0.68 6.12 ±1.25*銀屑片中劑量組 0.34 7.50 ±3.07*銀屑片低劑量組 0.17 8.12 ±2.03*雷公藤多苷片組 0.094 7.12 ±2.75*

5.4 銀屑片對(duì)鼠尾鱗片顆粒層形成的影響 結(jié)果表明，正常對(duì)照組缺乏或僅有少量的顆粒層，銀屑片高、中、低劑量組和雷公藤多苷片組顆粒層細(xì)胞均有不同程度的增加，促進(jìn)表皮正常分化。與對(duì)照組相比，銀屑片高、中、低劑量組均可顯著促進(jìn)鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成 （P＜0.05）， 且有良好的量效關(guān)系，見表3。

表3 各組小鼠鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成 （， n=8）Tab.3 Formation of granular layer in scale ep iderm is of m ice tails（， n=8）

表3 各組小鼠鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成 （， n=8）Tab.3 Formation of granular layer in scale ep iderm is of m ice tails（， n=8）

注: 與對(duì)照組比較，*P＜0.05

個(gè)鱗片對(duì)照組 生理鹽水組別 給藥劑量/（ g·kg-1·d-1）有顆粒層的鱗片數(shù)/ 100 8.12 ±2.59銀屑片高劑量組 0.68 18.75 ±3.28*銀屑片中劑量組 0.34 16.62 ±4.13*銀屑片低劑量組 0.17 14.38 ±5.26*雷公藤多苷片組 0.094 20.38 ±6.14*

6 討論

咪喹莫特是 Toll樣受體激動(dòng)劑。 近年臨床應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)在咪喹莫特外用治療已控制良好的銀屑病患者合并的日光性角化病及基底細(xì)胞癌時(shí)，可誘導(dǎo)或加重原有 銀屑 病 病 情［12-14］。 研究 進(jìn) 一 步發(fā) 現(xiàn) 咪 喹莫特外用于小鼠皮膚可誘導(dǎo)出典型銀屑樣炎癥［5-8］。 鼠尾鱗片因 表皮正 常角化缺乏顆粒層， 為自然角化異常，類似銀屑病角化不全病理生理改變。 Jarrett［15］和 Spearman 等［16］最早提出利用鼠尾鱗片表皮天然的角化形式模擬銀屑病表皮角化不全的特點(diǎn)。這兩種動(dòng)物模型模擬了人類銀屑病的某些病理生理學(xué)改變，可應(yīng)用于抗銀屑病藥物的篩選。

咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型有時(shí)間窗的限制，可認(rèn)為前8 d為疾病的發(fā)生、發(fā)展階段［17］。咪喹莫特模型組小鼠在涂藥 2 d 后即出現(xiàn)淡紅色斑點(diǎn)、片狀鱗屑和皮膚褶皺浸潤(rùn)現(xiàn)象。隨著藥物作用，紅斑增多且顏色變深，鱗片堆積漸成層，皮膚浸潤(rùn)增厚， 皮損癥狀在7～8 d最為嚴(yán)重。結(jié)果表明銀屑片能使咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損癥狀得到明顯緩解， PASI評(píng)分顯著降低， 組織形態(tài)變化趨于正常， 降低皮損中 PCNA的表達(dá)水平。并能顯著促進(jìn)鼠尾鱗片表皮顆粒層的形成，改善角化不全癥狀。因此研究認(rèn)為銀屑片對(duì)于銀屑病癥狀有很好的改善作用。此研究為臨床使用銀屑片治療銀屑病提供理論依據(jù)，而在治療銀屑病過程中銀屑片干預(yù)作用的靶點(diǎn)和通路將是今后繼續(xù)研究的方向和重點(diǎn)。

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Effects of Yinxie Tablets on m ice w ith psoriasis

HAN Shan-shan1， LIHui1， DANG Xiang-ji1， NIUQian-qian1， CHEN Meng-yu1， JIAOHai-sheng2*

（1.College of Pharmacy， Lanzhou University， Lanzhou730000， China;2.Maternity Department， The Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China）

AIM To evaluate the effects of Yinxie Tablets（ Angelicae sinensis Radix， Carthami Flos， Cardeniae Fructus， etc.） on mice models for psoriasis.METHODS Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation and the formation of scale epidermis granular layer inmouse tailwere used to study the therapeutic effects of Yinxie Tablets.RESULTS Compared with the model group， the cutaneous symptoms in Yinxie Tablets groups were alleviated， with psoriasis area and severity index（ PASI） scores decreased， epidermal parakeratosis and epidermal over-proliferation relieved， the expression of PCNA decreased.Compared with the normal group， the formation of scale epidermis granular layer inmouse tail in Yinxie Tablets groupswaspromoted.CONCLUSION Yinxie Tablets exhibit beneficial therapeutic effects on both psoriasismodels.

Yinxie Tablets;psoriasis;mice

R285.5

:A

1001-1528（2014）12-2463-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.004

2013-11-24

韓姍姍 （1989—）， 女， 碩士生， 從事臨床藥學(xué)研究工作。 Tel: （0931） 8942753

*通信作者: 焦 海勝 （1962 —） ， 男， 教 授， 碩 士生導(dǎo) 師， 主要 從事 新劑 型和臨 床藥 學(xué)研究 工 作。 Tel: （ 0931 ） 8942571 ， E-mail: ldeyjhs@sohu.com