朱振國 陳艷艷 黃艷君 張元濤 王新施 鄭榮遠(yuǎn)

●論 著

2-BFI對EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞及MCP-1的影響

朱振國 陳艷艷 黃艷君 張元濤 王新施 鄭榮遠(yuǎn)

目的 觀察2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉[2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline，2-BFI]對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞及MCP-1的影響，并探討其保護(hù)EAE大鼠的作用機(jī)制。方法50只雌性SD大鼠隨機(jī)分為EAE組、2-BFI低劑量組、2-BFI中劑量組、2-BFI高劑量組及對照組，每組10只，采用豚鼠脊髓勻漿免疫誘導(dǎo)SD大鼠建立EAE模型，觀察每組大鼠發(fā)病情況并進(jìn)行臨床癥狀評分；采用HE染色和LFB髓鞘染色觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理變化，對其炎癥浸潤程度加以評分；用免疫組化法測定腦干中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞及MCP-1陽性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果與EAE組比較，大、中、小劑量2-BFI干預(yù)組大鼠EAE發(fā)病率下降，臨床癥狀減輕，潛伏期延長，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤減少，2-BFI中劑量組在EAE臨床癥狀和病理學(xué)改變方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；免疫組化結(jié)果顯示，與EAE組比較，2-BFI中劑量組的活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)及MCP-1陽性細(xì)胞數(shù)均減少（P＜0．05）。結(jié)論中劑量2-BFI對EAE大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與2-BFI抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少MCP-1的表達(dá)有關(guān)。

2-BFI實驗性自身免疫性腦脊髓炎 多發(fā)性硬化 小膠質(zhì)細(xì)胞 MCP-1

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種主要以中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失、神經(jīng)變性為主要病理特征的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是其公認(rèn)的動物模型，在組織病理學(xué)方面與MS有許多相似性。免疫機(jī)制因素在MS及EAE的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要[1]。近年來有證據(jù)表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及分泌的單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）等多種細(xì)胞因子可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘損傷。2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉[2-（-2-benzofuranyl）-2-imidazoline，2-BFI]是1996年由Lione等[2]報道的一種新型、有選擇性的、高親和力的咪唑啉2受體的激動劑。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)I2R的非選擇性配體——咪唑克生對EAE大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，其可減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及MCP-1表達(dá)[3-4]。但目前鮮有關(guān)于2-BFI對EAE大鼠影響的研究。本研究觀察2-BFI對EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞及MCP-1的影響，探討其干預(yù)EAE的可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 成年雌性SD大鼠50只，6～8周齡，體重150～180g，清潔級；豚鼠12只，雌雄不拘，體重300～400g，均由溫州醫(yī)學(xué)院動物房提供。2-BFI購自英國Tocris公司；完全弗氏佐劑（CFA，含結(jié)核桿菌10g/ L）由美國Sigma公司提供；百日咳桿菌由衛(wèi)生部上海生物制品研究所提供；MCP-1抗體由武漢博士德公司提供；Iba1抗體由Abcam公司提供；SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 EAE模型的誘導(dǎo) 根據(jù)本實驗室建立的方法[5]，處死豚鼠，取出脊髓，在玻璃勻漿器充分混勻，加入CFA，制成抗原乳劑，當(dāng)天給予SD大鼠4個足墊皮下注射抗原乳劑0.4ml,同時腹股溝皮下注射0.1ml的百日咳菌苗（含1×109個菌體）。

1.2.2 實驗大鼠分組及藥物干預(yù) 將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別作以下處理：（1）EAE組：EAE模型基礎(chǔ)上，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml/d，連續(xù)10d；（2）2-BFI低劑量組：EAE模型基礎(chǔ)上，腹腔注射2-BFI 1.5mg/（kg·d），連續(xù)10d；（3）2-BFI中劑量組：EAE模型基礎(chǔ)上，腹腔注射2-BFI 3mg/（kg·d），連續(xù)10d；（4）2-BFI高劑量組：EAE模型基礎(chǔ)上，腹腔注射2-BFI 6mg/（kg·d），連續(xù)10d；（5）對照組：大鼠4個足墊皮下注射0.4ml 0.9%氯化鈉溶液，每天腹腔注射1ml的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)10d。

1.2.3 動物行為學(xué)評價 免疫當(dāng)日開始，每日早晚各2次觀察動物行為學(xué)方面的變化，予以詳細(xì)記錄。一直到第15天全部處死。臨床癥狀評分參考以下標(biāo)準(zhǔn)[6]：0分：無明顯異常；1分：尾巴無力；2分：輕微后肢無力；3分：嚴(yán)重后肢麻痹；4分：四肢麻痹；5分：瀕死或死亡。

1.2.4 病理學(xué)檢查 第15天處死大鼠，取出腦、脊髓，放于4%的多聚甲醛中固定24h。切取腦干做石蠟切片，進(jìn)行HE染色（切片厚5μm）和LFB髓鞘染色（切片厚10μm）。根據(jù)Okuda等[7]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)評分：0分：無炎癥變化；1分：炎癥細(xì)胞浸潤僅限于血管周和腦脊膜周圍；2分：腦實質(zhì)內(nèi)輕微的炎癥細(xì)胞浸潤，1～20個/片；3分：腦實質(zhì)內(nèi)中度的炎癥細(xì)胞浸潤，21～100個/片；4分：腦實質(zhì)內(nèi)嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤，＞100個/片。每張切片隨機(jī)計數(shù)5個視野后取平均值。

1.2.5 免疫組化法測腦干Iba1、MCP-1表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水。純化水沖洗，PBS浸泡，枸櫞酸緩液中加熱沸騰熱修復(fù)抗原，室溫冷卻,3%H2O2室溫孵育15min，PBS沖洗，3min×3次。滴加一抗（Iba1一抗以1∶200或MCP-1一抗以1∶100稀釋）4℃過夜。PBS沖洗,5min×3次。滴加對應(yīng)的二抗-HRP多聚體，37℃孵育20min, PBS沖洗，5min×3次。滴加DAB顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。同時設(shè)陰性對照片，用PBS代替一抗，余步驟相同。在顯微鏡下以腦干組織內(nèi)細(xì)胞染成棕褐色為免疫組化陽性染色，計數(shù)每張片內(nèi)隨機(jī)5個高倍視野（×400）。取Iba1或MCP-1陽性細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以頻數(shù)與百分率比較，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 動物發(fā)病情況 5組大鼠發(fā)病情況、神經(jīng)癥狀評分和病理評分比較見表1。EAE組大鼠于免疫后第10天左右開始發(fā)病，先出現(xiàn)精神萎靡，活動減少、體重下降，尾部張力消失，尾巴拖地不能抬起，繼而后肢無力，癱瘓。

表1 5組大鼠發(fā)病情況、神經(jīng)癥狀評分和病理評分的比較

由表1可見，與EAE組比較，3個2-BFI干預(yù)組的發(fā)病率下降，潛伏期延長，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；2-BFI干預(yù)后神經(jīng)癥狀評分較EAE組減輕，但僅2-BFI中劑量組較EAE組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而對照組未出現(xiàn)臨床癥狀，活動度正常，可見尾巴上翹、有力。

2.2 病理學(xué)改變 EAE組大鼠的腦干內(nèi)見大量炎性細(xì)胞浸潤，并可見神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死（圖1）。按Okuda病理評分，EAE組評分最高，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；給予2-BFI后，腦干內(nèi)浸潤的炎性細(xì)胞數(shù)較EAE組減少，以2-BFI中劑量組炎性細(xì)胞浸潤減少最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、表2）。LFB髓鞘染色發(fā)現(xiàn)，EAE組大鼠腦干內(nèi)存在廣泛的神經(jīng)髓鞘脫失。給予2-BFI后，大鼠腦干內(nèi)髓鞘脫失有不同程度減輕（圖2）。對照組大鼠腦干內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤和髓鞘脫失（圖1、2）。

圖1 5組大鼠腦干病理學(xué)改變（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組，HE染色，×100）

圖2 5組大鼠腦干髓鞘染色變化（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組；LFB髓鞘染色，×200）

2.3 2-BFI對EAE大鼠腦干內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響 小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，并參與EAE的發(fā)病過程。本實驗通過免疫組化檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物——離子鈣接頭分子（Iba1）的表達(dá)來觀察活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的變化。EAE組發(fā)病大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增加，形態(tài)上呈激活的“阿米巴”狀，染色加深（圖3A）。而3個2-BFI干預(yù)組大鼠腦干內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和染色強(qiáng)度較EAE組均減少，與炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度相一致。其中以2-BFI中劑量組與EAE組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3、表2）；而對照組腦干內(nèi)僅見少量細(xì)小分枝樣突起的小膠質(zhì)細(xì)胞。

圖3 5組大鼠腦干內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組；免疫組化，×400）

2.4 2-BFI對EAE大鼠腦干內(nèi)MCP-1表達(dá)的影響腦內(nèi)MCP-1主要在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，正常腦組織不表達(dá)MCP-1，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害刺激，如免疫損害，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，在MCP-1作用下迅速增殖并向受損部位遷徙，加重免疫損害。EAE組大鼠腦干內(nèi)可見較多細(xì)小突起著色的MCP-1陽性細(xì)胞，樹突數(shù)目增多，為胞質(zhì)胞膜著色。3個2-BFI干預(yù)組大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的MCP-1陽性細(xì)胞染色數(shù)目較EAE組均減少，染色較淺，但僅2-BFI中劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4、表2）。對照組腦干內(nèi)未見明顯MCP-1陽性表達(dá)。

3 討論

大量研究顯示，咪唑啉2受體（I2R）廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，可參與腦內(nèi)多種功能的調(diào)節(jié)，與腦卒中、帕金森病、脫髓鞘性疾病等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。它的非選擇性激動劑咪唑克生（1.5～4.5mg/kg）能夠明顯緩解EAE大鼠的脊髓損傷[3]。2-BFI是近年來才發(fā)現(xiàn)的與I2R有更高親和力的選擇性激動劑。參考韓釗等[9]的報道，本實驗選擇1.5mg/kg、3mg/kg和6mg/kg三種劑量的2-BFI對EAE大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)2-BFI中劑量組臨床癥狀明顯改善，神經(jīng)癥狀評分明顯降低，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，而高、低劑量組作用不明顯，提示3mg/kg 2-BFI對EAE大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。2-BFI對EAE干預(yù)作用存在最佳劑量，推測可能的原因為劑量太小，效果變?nèi)酰珓┝刻?，增加的效果可能被藥物的不良反?yīng)抵消。

圖4 5組大鼠腦干MCP-1表達(dá)的變化（A：EAE組；B：2-BFI低劑量組；C：2-BFI中劑量組；D：2-BFI高劑量組；E：對照組；免疫組化×400）

表2 2-BFI對大鼠腦干內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞、MCP-1變化的影響

大量研究已證實小膠質(zhì)細(xì)胞參與EAE的發(fā)病，它不但具有抗原遞呈細(xì)胞功能，而且產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，從而趨化大量抗原非特異性淋巴細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞，誘發(fā)和加重炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致脫髓鞘和神經(jīng)系統(tǒng)的損害[10]。此外，EAE發(fā)生的一個關(guān)鍵步驟是抗原特導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞和抗原非特異性單個核細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。MCP-1是重要的炎性介質(zhì)，主要由小膠質(zhì)細(xì)胞分泌，參與免疫反應(yīng)的炎性細(xì)胞的趨化、激活等活動。研究發(fā)現(xiàn)主動免疫后的MCP-1-/-小鼠沒有出現(xiàn)EAE臨床癥狀，拮抗MCP-1或其受體的功能均可以大大減輕EAE的發(fā)生。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和MCP-1的表達(dá)是改善EAE發(fā)病的有效途徑。厲芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)2-BFI可以下調(diào)C57BL/6 EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎性因子IL-17的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)損傷。本實驗結(jié)果顯示，EAE組大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)大量小膠質(zhì)細(xì)胞活化和MCP-1表達(dá)增多，給予2-BFI干預(yù)后，在EAE模型大鼠發(fā)病高峰期可觀察到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞減少和MCP-1表達(dá)水平降低。提示2-BFI不但抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而且抑制EAE過程中趨化因子和炎性因子的表達(dá)，從而減輕了對炎性細(xì)胞的趨化、激活作用，最終減輕臨床癥狀。

綜上所述，中劑量3mg/kg 2-BFI能減輕EAE臨床癥狀和病理組織學(xué)損傷程度，對EAE大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與2-BFI抑制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少MCP-1的表達(dá)有關(guān)，但是具體的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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Effect of 2-BFI on microglia activation and MCP-1 expression in central nervous system of rats with experimental autoimmune en-cephalomyelitis

Objective To investigate the effects of 2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline(2-BFI)on microglia activation and MCP-1 expression in central nervous system(CNS)of rat with experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)．MethodsFifty female Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups：control group(n=10),EAE model group(n=10),low dose(1．5mg/kg)2-BFI group(n=10),intermediate dose(3 mg/kg)2-BFI group(n=10)and high dose(6mg/kg)2-BFI group (n=10)．The model of EAE was induced by injection of guinea pigs spinal cord homogenate(GPSCH)in SD rats．The severity of EAE was scored according to the signs and symptoms．The pathological changes were observed with Hematoxylin-eosin staining and Luxol Fast blue dyeing,then the degree of inflammatory infiltration was evaluated．The changes of activated microglia and MCP-1 positive cells in brainstem were counted by immunohistochemistry．ResultsCompared with EAE group,rats in intermediate dose 2-BFI treatment groups had lower incidence of disease,prolonged latency,decreased CNS inflammation and demyelination(P＜0．05)．Immunohistochemical results showed that the numbers of activated microglia and MCP-1 positive cells were significantly reduced in intermediate dose 2-BFI group compared with the EAE group(P＜0．05)．Conclusion2-BFI at intermediate dose(3mg/kg)has a beneficial neuroprotective effect on EAE,which may be related to inhibition of microglia activation and reduction of MCP-1 expression．

2-BFIExperimental autoimmune encephalomyelitis Multiple sclerosis Microglia MCP-1

2013-03-05）

（本文編輯：楊麗）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81070960）；溫州市科技局資助項目（Y20090285）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科（朱振國、陳艷艷、張元濤、王新施、鄭榮遠(yuǎn)），婦產(chǎn)科（黃艷君）