殷憲剛 葛榮 周新成 陳金平 夏朝霞

食管鱗癌中MEKK3和NF-κB的表達(dá)及其臨床意義

殷憲剛 葛榮 周新成 陳金平 夏朝霞

目的 研究有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（MEKK3）、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集76例食管鱗癌患者的癌組織及相應(yīng)的35例癌旁異型增生組織和20例正常食管黏膜組織，應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測(cè)MEKK3、NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果食管鱗癌組織中MEKK3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁異型增生組織和正常食管黏膜組織（均P＜0．05）；NF-κB蛋白表達(dá)陽(yáng)性率在正常食管黏膜組、癌旁異型增生組、食管鱗癌組中依次升高；MEKK3、NF-κB蛋白表達(dá)與臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)（均P＜0．05），而與患者年齡、性別及組織學(xué)分級(jí)均無(wú)關(guān)（均P＞0．05）；MEKK3與NF-κB蛋白的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0．308，P＜0．05）。結(jié)論MEKK3、NF-κB蛋白異常表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，且兩者呈正相關(guān)。聯(lián)合檢測(cè)MEKK3和NF-κB蛋白表達(dá)可作為食管鱗癌的診斷、預(yù)后評(píng)估的參考依據(jù)。

有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3 核轉(zhuǎn)錄因子 食管鱗癌

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）具有多向調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)控體內(nèi)多種生理和病理過(guò)程。有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3，MEKK3）是一種屬于MAP3K家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[1]。既往研究證實(shí)MEKK3與乳腺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而MEKK3與NF-κB在食管鱗癌發(fā)生中的作用及其相互關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組化EnVision法檢測(cè)食管鱗癌組織、癌旁異型增生組織和正常食管黏膜組織中MEKK3、NF-κB蛋白的表達(dá)，以探討MEKK3、NF-κB蛋白異常表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生的關(guān)系及其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取本中心2011-06—2012-12食管癌手術(shù)切除標(biāo)本76例，所有病例均經(jīng)3位病理專(zhuān)家重復(fù)讀片證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。癌旁組織距癌組織邊緣3cm以?xún)?nèi)，正常組織取自手術(shù)殘端，距癌組織3cm以上。以簡(jiǎn)單隨機(jī)法從76例標(biāo)本中選取相應(yīng)的癌旁異型增生組織標(biāo)本35例及相對(duì)正常的食管黏膜標(biāo)本20例?；颊咧心?5例，女31例；年齡41～81歲，平均（61.3±7.1）歲；組織學(xué)分級(jí)：高中分化49例，低分化27例；按UICC（1997）TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期47例，Ⅲ+Ⅳ期29例；浸潤(rùn)深度：淺肌層浸潤(rùn)26例，深肌層浸潤(rùn)28例，漿膜層22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。所有組織標(biāo)本均固定于4%多聚甲醛中并以石蠟包埋。

1.2 試劑 鼠抗人MEKK3單克隆抗體ab40756為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體、EnVision試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化EnVision法檢測(cè)MEKK3、NF-κB蛋白的表達(dá)。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用已知的陽(yáng)性對(duì)照片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 MEKK3以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)；NF-κB陽(yáng)性則主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。每一張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，凡細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，以細(xì)胞無(wú)棕色或與背景一致的淡棕色為陰性細(xì)胞。切片內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%判定為陰性，≥10%判定為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 MEKK3和NF-kB蛋白在食管鱗癌組織、癌旁異型增生組織和正常食管黏膜組織中的表達(dá) MEKK3蛋白陽(yáng)性率在正常食管黏膜組（15.0%）、癌旁異型增生組（44.4%）、食管鱗癌組（84.2%）中依次升高；NF-κB蛋白陽(yáng)性率也在正常食管黏膜組（10.0%）、癌旁異型增生組（40.0%）、食管鱗癌組（72.4%）中依次升高，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。食管鱗癌組織中MEKK3和NF-κB呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1-2。

2.2 MEKK3和NF-kB蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 MEKK3、NF-κB蛋白表達(dá)分別與食管鱗癌臨床分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0.05）；而與患者性別、年齡及病理分級(jí)無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 MEKK3和NF-κB蛋白在食管鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性 在食管鱗癌組織中，MEKK3蛋白陽(yáng)性率84.2%（64/ 76），NF-κB蛋白陽(yáng)性率72.4%（55/76），兩者共同陽(yáng)性率65.8%（50/76）。MEKK3和NF-κB蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.308，P＜0.05）。

圖1 MEKK3在食管鱗癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（EnVision法，× 400）

圖2 NF-κB在食管鱗癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（EnVision法，× 400）

表1 MEKK3和NF-κB蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3 討論

食管癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。50.0%的食管癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或已經(jīng)無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除，而其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚。因此，研究與食管癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子對(duì)診斷治療有重要意義。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，因此腫瘤細(xì)胞異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MAPK和NF-κB信號(hào)途徑的過(guò)度激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NF-κB可調(diào)控多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)，由此參與調(diào)控體內(nèi)多種生理和病理過(guò)程。NF-κB異常活化能保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡，并與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥相關(guān)[3]。MEKK3是一種屬于MAP3K家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[2]。該蛋白激酶通過(guò)激活包括JNK、p38、ERK5在內(nèi)的MAPKs和NF-κB信號(hào)通路，調(diào)控早期胚胎心血管系統(tǒng)的發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖凋亡、肌細(xì)胞的形成并參與各種炎癥和免疫應(yīng)答過(guò)程[4]。研究已證明MEKK3是脂多糖、TNF-α及IL-1介導(dǎo)的NF-κB激活的重要調(diào)控激酶[5]。MEKK3可激活NF-κB抑制物激酶（IKKs），后者可磷酸化NF-κB復(fù)合物中的抑制成分IκB使其激活。NF-κB與IκB結(jié)合處于非活化狀態(tài)，IκB磷酸化后可與NF-κB分離，導(dǎo)致NF-κB的持續(xù)活化，活化的NF-κB遷移至核內(nèi)，在核內(nèi)起轉(zhuǎn)錄因子的作用，可誘導(dǎo)眾多炎性相關(guān)的基因如TNF-α、IL-6和IL-8等的表達(dá)及調(diào)控相關(guān)癌基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB過(guò)度激活與許多惡性腫瘤有關(guān)，如乳腺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌[7]、肺癌等。Samanta等[8]發(fā)現(xiàn)乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)MEKK3蛋白可導(dǎo)致NF-κB活性增強(qiáng)，并與此兩種癌細(xì)胞持續(xù)抵抗凋亡密切相關(guān)；Chiao等[9]發(fā)現(xiàn)人肝癌Hep3B細(xì)胞中MEKK3的高表達(dá)可使Rel/NF-κB的活性增加，從而抑制了肝癌細(xì)胞的凋亡；Lin等[10]發(fā)現(xiàn)MEKK3及其下游信號(hào)分子ERK在肺腺癌A549細(xì)胞中異常激活與癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，MEKK3在由正常食管黏膜組織、癌旁異型增生組織到食管鱗癌組織的演進(jìn)過(guò)程中其蛋白陽(yáng)性表達(dá)率依次升高，三者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示MEKK3蛋白的高表達(dá)可能成為食管鱗癌發(fā)生的早期標(biāo)志物，對(duì)于食管鱗癌的早期診斷有一定的臨床意義。進(jìn)一步研究顯示，MEKK3蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者性別，年齡及組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)，提示MEKK3可能參與食管鱗癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程，并可能與患者的預(yù)后有關(guān)。而NF-κB蛋白陽(yáng)性率在食管鱗癌組織高于癌旁異型增生組織及正常食管黏膜組織，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步研究顯示，NF-κB表達(dá)與食管鱗癌臨床分期、腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者性別，年齡、腫瘤大小及病理分型無(wú)關(guān)，表明NF-κB蛋白過(guò)表達(dá)參與了食管鱗癌的發(fā)生、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。

此外，本研究還提示MEKK3和NF-κB蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，表明兩者可能在食管鱗癌的發(fā)生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起到一定程度的協(xié)同作用。由此筆者推測(cè)MEKK3表達(dá)可能增強(qiáng)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性，最終導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于腫瘤早期診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)及闡明食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制具有重要臨床意義。

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Expression of MEKK3,NF-κB proteins in esophageal squamous cell carcinoma and their clinical significance

Objective To study the expression of mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3(MEKK3)and nuclear factor kappa B(NF-κB)proteins in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and their clinical significance．MethodsThe expression of MEKK3 and NF-κB proteins in 76 cases of ESCC,35 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 20 cases of normal tissue were detected by immunohistochemistry EnVision method．ResultsThe positive rates of MEKK3 protein in ESCC tissue were significantly higher than those of atypical hyperplasia tissue and normal tissue(P＜0．05)．The positive rates of NF-κB protein were increased gradually in ESCC tissue,atypical hyperplasia tissue and normal tissue．In ESCC tissue,the positive expression of MEKK3 and NF-κB proteins was both correlated with the clinical stage,infiltration depth and lymph node metastasis(all P＜0．05),but not correlated with age,sex,or degree of differentiation(all P＞0．05)．Expression of MEKK3 protein was positively associated with expression of NF-κB(r=0．308,P＜0．05)．ConclusionThe expression of MEKK3 and NF-κB proteins can be used as a indicator for the diagnosis of ESCC and the prognosis of patients．

MEKK3 NF-κB Esophageal squamous cell carcinoma

2013-05-27）

（本文編輯：胥昀）

315031 寧波市臨床病理診斷中心診斷部

殷憲剛，E-mail:yinxiangang@126.com