張斌杰 樂(lè)涵波 張永奎 劉曉光 周吉航 竺王玉 陳志軍

MiRNA-24在良、惡性胸水鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值研究

張斌杰 樂(lè)涵波 張永奎 劉曉光 周吉航 竺王玉 陳志軍

目的 研究良性與惡性胸水中miRNA表達(dá)的差異，為臨床早期鑒別良、惡性胸水提供依據(jù)。方法抽取18例肺癌患者及10例肺部良性病變患者的胸水，運(yùn)用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR法檢測(cè)let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表達(dá)水平，分析其在良、惡性胸水中的表達(dá)差異。結(jié)果miRNA-24在惡性胸水中的表達(dá)高于在良性胸水中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．032），而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在良、惡性胸水中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．076、0．320、0．076、0．372）。結(jié)論miRNA-24在惡性胸水中高表達(dá)，檢測(cè)胸水中miRNA-24的表達(dá)水平可能是新的鑒別胸水良、惡性的手段。

胸腔積液 microRNA 診斷

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，在我國(guó)其病死率仍呈明顯上升趨勢(shì)，其病死人數(shù)已位居國(guó)內(nèi)各類腫瘤死亡人數(shù)首位[1]。胸腔積液（胸水）是肺癌等多種胸部疾病常伴發(fā)的一個(gè)重要臨床表現(xiàn)。鑒別胸水的良、惡性對(duì)患者的治療及預(yù)后具有重要意義。特別是對(duì)于僅有胸腔積液，但影像學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)均為陰性的患者，胸水良、惡性的鑒別具有重要的診斷意義。miRNA是一類存在于真核細(xì)胞中的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，通過(guò)與目標(biāo)mRNA的3′非編碼區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制miRNA的翻譯，導(dǎo)致基因沉默。近年多項(xiàng)研究表明，miRNA與多種人類惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡有著密切的聯(lián)系[2-3]。

本研究檢測(cè)肺癌及肺部良性病變患者的let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表達(dá)差異，并與胸水癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）進(jìn)行比較，分析miRNA表達(dá)水平在良、惡性胸水鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2011-01—2012-12我院抽取胸水的患者共28例。其中肺癌患者（除肺癌外無(wú)其他主要疾病，惡性胸水組）18例，男10例，女8例，年齡43～89（62.5±11.9）歲；肺部良性病變患者（良性胸水組）10例，男5例，女5例，年齡39～91（64.1±13.9）歲。所有胸水標(biāo)本均在抽取后半小時(shí)內(nèi)放入-80℃冰箱中凍存。

1.2 方法

1.2.1 抽提胸水miRNA 使用美國(guó)ABI公司試劑盒抽提胸水中的miRNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。抽提的miRNA濃度采用ABI公司的TaqMan探針利用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)并分析。

1.2.2 莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR法檢測(cè)胸水中miRNAs表達(dá) 以U6為內(nèi)參，let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a與U6同批擴(kuò)增，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，取平均值。應(yīng)用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)ABI公司）將miRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為10×RT緩沖液 0.75μl，RNA酶抑制劑0.095μl，dNTP0.075μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，引物1.5μl，模板1.5μl，用DEPC水稀釋到7.5μl，反應(yīng)條件為16℃30min，42℃30min，85℃5min；應(yīng)用7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）檢測(cè)miRNA表達(dá)，試劑為TaqMan通用混合液Ⅱ，反應(yīng)體系為10μl TaqMan無(wú)尿素酶2×通用PCR混合液,1μl基因特異引物，1μl模板，DEPC水稀釋至20μl，反應(yīng)條件為95℃10min，95℃15s 40個(gè)循環(huán)，60℃1min。循環(huán)數(shù)（Ct）值由SDS 2.0.1 Software（美國(guó)ABI公司）計(jì)算，以U6為內(nèi)參，計(jì)算miRNA的2-ΔCt值。無(wú)核苷酸水代替模板的反應(yīng)體系為陰性對(duì)照，肺癌細(xì)胞株A549作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 胸水CEA、CA19-9檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)胸水中CEA、CA19-9水平，使用Beckman Coulter公司UnicelDXI800化學(xué)發(fā)光儀及原配套試劑。CEA＞5.0ng/ ml，CA19-9＞37.0IU/ml判定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 良、惡性胸水中miRNAs表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 良、惡性胸水中miRNA表達(dá)（2-ΔCt）

由表1可見(jiàn)，miRNA-24在惡性胸水中的表達(dá)明顯高于在良性胸水中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在惡性胸水中的表達(dá)雖然高于在良性胸水中的表達(dá)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.076，0.320，0.076，0.372）。

2.2 良、惡性胸水CEA、CA19-9表達(dá) 良、惡性胸水的腫瘤標(biāo)志物的含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，CEA與CA19-9在惡性胸水中的水平[（1160±515.4）、（237.6±96.2）ml]均明顯高于良性[（237.6±96.2）、（10.16±6.461）ml]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。在良、惡性胸水中，mirRNA-24與CEA和CA199的表達(dá)均無(wú)明顯相關(guān)性（r=-0.086，P＞0.05）。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)對(duì)miRNA的研究主要集中于血清及腫瘤細(xì)胞上，對(duì)胸水中miRNA的研究相對(duì)較少，胸水的抽取或者引流本身即為胸腔積液患者治療的一種基本方法，其操作創(chuàng)傷性相對(duì)較小，獲得的標(biāo)本量較大，是一種比較理想的檢測(cè)標(biāo)本。所以，通過(guò)檢測(cè)胸水中miRNA的種類與含量來(lái)鑒別胸水的良、惡性有重要的意義與較好的實(shí)用性。

我們運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)良、惡性胸水中l(wèi)et-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miRNA-24在惡性胸水中的表達(dá)高于在良性胸水中的表達(dá)，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在良、惡性胸水中的表達(dá)雖然也有差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Xie等[4]應(yīng)用一種外源性的植物miRNA-athmiRNA-156a作為內(nèi)參，對(duì)110例胸水（包括28例良性，82例惡性）中miRNA-24及miRNA-30d的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-24和miRNA-30d在惡性胸水中的表達(dá)要明顯高于在良性胸水中的表達(dá)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果與Xie等的研究結(jié)果不完全相同，出現(xiàn)這種差異可能與兩個(gè)研究的研究樣本量均偏小以及兩個(gè)研究所選用的內(nèi)參基因不同有關(guān)。

miRNA-24在細(xì)胞中主要起到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡的功能。在不同腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展及凋亡過(guò)程中，其既可能作為原癌基因存在，又可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。Xie等[5]通過(guò)研究肺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：miRNA-24可以通過(guò)降低X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）的表達(dá)，從而降低腫瘤細(xì)胞凋亡的閾值，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。而Cameron等[6]通過(guò)研究受到EB病毒感染的B淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在這些受感染的B淋巴細(xì)胞中miRNA-24的表達(dá)水平明顯升高，提示miRNA-24可能在EB病毒介導(dǎo)的淋巴瘤的發(fā)生過(guò)程中起促進(jìn)作用。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，惡性胸水中CEA及CA19-9的表達(dá)水平亦高于良性胸水，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示CEA及CA19-9可作為良、惡性胸水的一項(xiàng)鑒別指標(biāo)。我們進(jìn)一步分析了胸水中miRNA-24與CEA、CA19-9的相關(guān)性，結(jié)果分析表明胸水中miRNA-24與CEA及CA19-9之間無(wú)相關(guān)性。上述結(jié)果提示胸水miRNA-24、CEA及CA19-9均可以用于鑒別良、惡性胸水，其中miRNA-24可作為一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素，與胸水CEA、CA19-9無(wú)關(guān)，對(duì)于胸水CEA、CA19-9陰性的惡性胸水患者有一定的鑒別意義。

綜上所述，miRNA-24在良、惡性胸水中的表達(dá)存在明顯差異，其可作為良、惡性胸水鑒別的一項(xiàng)有效指標(biāo)。與胸水中傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CEA及CA19-9相比，miRNA-24是一項(xiàng)獨(dú)立的惡性胸水的預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)胸水CEA、CA19-9陰性的患者有一定的預(yù)測(cè)意義。胸水miRNA-24的表達(dá)情況的檢測(cè)可以作為一種新的鑒別良、惡性胸水的方法，值得推廣應(yīng)用。

[1]Guo P,Huang Z L,Yu P,et al．Trends in cancer mortality in China：an update[J]．Annals of Oncology,2012,23(10)：2755-2762．

[2]Brennecke J,Hipfner D R,Stark A,et al．Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the pro-apoptotic gene hid in Drosophila[J]．Cell, 2003,113(1)：25-36．

[3]Gupta G P,Massagué J．Cancer metastasis：building a framework[J]．Cell,2006,127(4)：679-695．

[4]Xie L,Wang T,Yu S,et al．Cell-free miR-24 and miR-30d,potential diagnostic biomarkers in malignant effusions[J]．Clinical Biochemistry．2011,44(2-3)：216-220．

[5]Xie Y,Tobin L A,Camps J,et al．MicroRNA-24 regulates XIAP to reduce the apoptosis threshold in cancer cells[J]．Oncogene,2013, 32(19)：2442-2451．

[6]Cameron J E,Fewell C,Yin Q,et al．Epstein-Barr virus growth/latency III program alters cellular microRNA expression[J]．Virology, 2008,382(2)：257-266．

MicroRNA-24 is expressed at high level in malignant pleural effusion

Objective To investigate the expression levels of microRNAs in malignant and benign pleural effusion．MethodsPleural effusion samples were collected from 18 cases of lung cancer and 10 cased of benign diseases．The expression levels of let-7b,miRNA-24,miRNA-27b,miRNA-30d and miRNA-128a in the pleural effusion were detected with stem loop primer FQ RT-PCR method．ResultsThe expression of miRNA-24 in malignant pleural effusion was higher than that in benign pleural effusion(P=0．032);however there were no significant difference in expression of Let-7b,miRNA-27b,miRNA-30d and miRNA-128a between malignant and benign pleural effusion(P=0．076,0．320,0．076 and 0．372,respectively)．ConclusionmiRNA-24 is expressed at higher level in malignant pleural effusion,indicating that miRNA-24 may be used to differentiate malignant pleural effusion from benign one．

Pleural effusion MicroRNA Diagnosis

2013-05-24）

（本文編輯：楊麗）

浙江省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目（2011KYB165）；舟山市科技局重大項(xiàng)目（2011C12039）

316000 舟山醫(yī)院胸心外科

樂(lè)涵波，E-mail:zslehanbo@163.com