周金偉， 易有金*， 柏連陽， 曹 熙， 田 建， 程遠渡

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全學(xué)院，長沙 410128）

大孔樹脂對內(nèi)生菌011發(fā)酵液中抗菌成分的吸附和解吸特性研究

周金偉1，2， 易有金1，2*， 柏連陽3， 曹 熙1，2， 田 建1，2， 程遠渡1，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全學(xué)院，長沙 410128）

摘要011是從煙草莖中分離得到的一株對植物病原真菌有強烈抑制作用的內(nèi)生細菌，為了明確其發(fā)酵液中的抗菌活性成分，并探索活性成分的大孔樹脂吸附條件，本試驗采用X-5型、AB-8型和CAD-40型3種樹脂對其發(fā)酵產(chǎn)物進行了吸附與解吸試驗，探討樹脂類型、上樣量、解吸劑、解吸劑體積分?jǐn)?shù)及p H對吸附與解吸效果的影響。結(jié)果表明，在3種樹脂中，CAD-40型樹脂的吸附率及解吸率均顯著高于X-5型和AB-8型樹脂，其最佳上樣量為樹脂質(zhì)量的15倍。選擇70%的乙醇在p H為7時能獲得最佳的解吸效果。

關(guān)鍵詞內(nèi)生菌； 抗菌活性； 大孔樹脂； 吸附率； 解吸率

植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織中，不引起宿主植物出現(xiàn)明顯癥狀的微生物［1］。植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)［2］，包括生物堿、抗菌肽、甾體、萜類、酚類等，這些物質(zhì)大多具有抗菌活性［3］。因此，植物內(nèi)生菌被稱為天然活性物質(zhì)合成的生物工廠［4］。從植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中分離生物活性物質(zhì)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生和工業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

011菌是從煙草組織中分離得到的一株內(nèi)生細菌，前期研究結(jié)果表明，該菌對煙草青枯病具有良好的防治效果［5］。然而，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)尚不明確，且其產(chǎn)物成分復(fù)雜，增加了分離純化的難度，因此有必要對其活性成分進行初步純化。

大孔吸附樹脂為一種選擇性有機高聚吸附劑，具有吸附量大、選擇性好、吸附速度快、再生簡便等優(yōu)點，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化［6］。本文基于011菌發(fā)酵液的抗菌活性，篩選大孔吸附樹脂，優(yōu)化吸附和解吸條件，為抗菌活性物質(zhì)的進一步分離純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

內(nèi)生短短芽胞桿菌011由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室分離、鑒定與保藏。供試真菌辣椒疫病菌（Phytophthora capsici Leonlan）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

BPY液體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基［7］。

1.1.3 主要試劑

大孔吸附樹脂：X-5型、AB-8型和CAD-40（安徽三星樹脂科技有限公司），樹脂性能見表1；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純。

表1 三種吸附樹脂的物理性能Table 1 Physical properties of three types of macroporous resins

1.2 方法

1.2.1 011菌株發(fā)酵液的制備及預(yù)處理

種子液制備：將斜面保存的011菌株接入BPY培養(yǎng)液中，裝液量100 m L／250 m L，p H 7.0、30℃、180 r／min振蕩培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：種子液以1%接種量接種到BPY培養(yǎng)基中，裝液量100 m L／250 m L，p H 7.0、30℃、180 r／min振蕩培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵液預(yù)處理：所得發(fā)酵液于60℃水浴濃縮，去除2倍體積的水，10 000 r／min離心10 min，去除菌體，上清液用0.45μm濾膜除菌，得發(fā)酵濾液備用。

1.2.2 011菌株發(fā)酵液抑菌活性的測定

抑菌活性采用平皿打孔法［8-9］：將辣椒疫病菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，28℃下培養(yǎng)24 h，在離菌落邊緣2.0 cm處打孔（d＝6 mm），每孔加100μL發(fā)酵濾液，以無菌水作為空白對照，28℃培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈大小，計算抑菌率，3次重復(fù)。

式中，Dc為處理菌落半徑；Dd為對照菌落半徑。

1.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附率及解吸率測定

根據(jù)極性強弱，選擇3種大孔吸附樹脂，分別為X-5（非極性）、AB-8（弱極性）及CAD-40（中極性）。取3種活化好的樹脂各1 g，加入到50 m L三角瓶中，每瓶加入發(fā)酵濾液20 m L。30℃、180 r／min振蕩吸附4 h。吸附后，分開濾液與樹脂，蒸餾水洗去多余殘液，加入75%乙醇20 m L，30℃、180 r／min振蕩解吸4 h。解吸液于60℃減壓濃縮至干，加10 m L無菌水溶解，以發(fā)酵濾液為對照，平皿打孔法測定吸附殘液及解吸液抑菌活性，計算各吸附樹脂的吸附率及相對解吸率。

式中Qa—吸附率；C1—吸附殘液抑菌圈半徑；C2—發(fā)酵濾液抑菌圈半徑；Qb—相對解吸率；C3—解吸液抑菌圈半徑。

1.2.4 吸附量優(yōu)化

取活化好的CAD-40樹脂各1 g，置于50 m L三角瓶中，每瓶分別加入5、10、15、20、25、30 m L發(fā)酵濾液，振蕩吸附同前。吸附后，以發(fā)酵濾液為對照，平皿打孔法測定吸附殘液抑菌活性，計算吸附率。

1.2.5 大孔樹脂解吸劑的篩選

取活化好的CAD-40樹脂各1 g，置于50 mL三角瓶中，每瓶分別加入15 mL發(fā)酵濾液，振蕩吸附同前。吸附后，分開濾液與樹脂，蒸餾水洗去多余殘液，分別加入70%甲醇、70%乙醇及70%丙酮15 m L，30℃、180 r／min振蕩解吸4 h。解吸液于60℃減壓濃縮至干，加10 mL無菌水溶解，以發(fā)酵濾液為對照，平皿打孔法測定解吸液抑菌活性，計算相對解吸率。

1.2.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸的影響

取吸附飽和的CAD-40樹脂7份，每份1 g，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇15 m L，30℃、180 r／min振蕩解吸4 h。解吸液于60℃減壓濃縮至干，加10 m L無菌水溶解，以發(fā)酵濾液為對照，平皿打孔法測定解吸液抑菌活性，每處理3次重復(fù)。

1.2.7 p H對CAD-40樹脂解吸效果的影響

取吸附飽和的CAD-40樹脂6份，每份1 g，各加入15 mL乙醇，調(diào)p H分別為2、4、6、7、8、10，30℃、180 r／min振蕩解吸4 h。解吸液于60℃減壓濃縮至干，加10 mL無菌水溶解，以發(fā)酵濾液為對照，平皿打孔法測定解吸液抑菌活性，每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 011菌株發(fā)酵濾液抑菌活性

圖1結(jié)果表明，011菌發(fā)酵濾液對辣椒疫病菌有很好的抑制效果，隨著稀釋倍數(shù)的增加，其抑菌效果逐漸降低。發(fā)酵濾液、2倍稀釋液、3倍稀釋液的抑菌率分別為64.7%、57.6%和48.3%。

2.2 大孔樹脂對發(fā)酵濾液抗菌成分的吸附和解吸性能比較

由表2可知，發(fā)酵濾液經(jīng)X-5、AB-8及CAD-40型樹脂吸附后的殘液仍具有抑菌活性，表明抑菌物質(zhì)難以被完全吸附。而在相同條件下，CAD-40型樹脂的吸附率顯著（P＜0.05）高于X-5、AB-8型樹脂。

圖1 011發(fā)酵濾液對辣椒疫病菌體外抑菌效果Fig.1 Inhibitory effects of the ferment of the strain 011 on Phytophthora capsici

用75%乙醇解吸后，3種樹脂的相對解吸率均較高，而CAD-40型樹脂的解吸率顯著高于另外兩種樹脂（P＜0.05）。

表2 大孔樹脂對發(fā)酵濾液抗菌物質(zhì)的吸附及解吸性能1）Table 2 The adsorption and desorption capacities of three types of macroporous resins on the ferment of the strain 011

2.3 上樣量對CAD-40吸附效果的影響

由圖2可知，上樣量影響CAD-40型樹脂的吸附率。當(dāng)上樣量小于15 mL時，其吸附率為100%，達到吸附飽和。隨著上樣量的增加，其吸附率逐漸下降。因此，可以確定最佳上樣量為樹脂量的15倍。

圖2 上樣量對CAD-40型樹脂吸附率的影響Fig.2 Effects of sample weight on the desorption rate of CAD-40

2.4 解吸劑對大孔樹脂解吸性能的影響

分別用70%的甲醇、乙醇及丙酮對吸附后的CAD-40型樹脂進行解吸，其結(jié)果見圖3。由圖3可知，相同濃度的甲醇、乙醇及丙酮對樹脂的解吸率分別為79.4%、96.8%和87.3%，其中，乙醇的解吸率顯著高于甲醇和丙酮（P＜0.05）。且乙醇的毒性相對較小，不會造成環(huán)境污染和人體傷害，因此，本試驗擬選用乙醇作為初步純化的解吸劑。

圖3 解吸劑對CAD-40型樹脂解吸率的影響Fig.3 Effects of eluant on the desorption rate of CAD-40

2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸效果的影響

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時（p H＝6.6），抗菌活性成分有較好的解吸作用，解吸率為96.7%，達到最大值。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于或高于70%時，解吸能力均逐漸下降，40%乙醇和無水乙醇的解吸率均只有33.3%。因此，70%乙醇可作為最佳解吸劑。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對CAD-40型樹脂解吸率的影響Fig.4 Effects of ethanol volume fraction on the desorption rate of CAD-40

2.6 p H對解吸效果的影響

由圖5可知，p H為7時，CAD-40型樹脂解吸率最高，達97.7%。p H升高或降低其解吸能力均下降。當(dāng)p H低于6時，解吸率下降顯著。p H為2時的解吸率只有43.9%。因此，p H為7利于抗菌活性物質(zhì)的解吸，定為解吸p H。

圖5 p H對CAD-40型樹脂解吸率的影響Fig.5 Effects of p H on the desorption rate of CAD-40

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生菌幾乎存在于所有植物中，不僅能促進植物生長，而且其產(chǎn)生的天然產(chǎn)物可用作生防因子，用于植物病蟲害的防治，成為新型殺菌劑研發(fā)的潛在資源和熱點［10］。從植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中篩選出抗菌、抗病毒、抗腫瘤等具有生物活性的天然產(chǎn)物是新藥研究與開發(fā)的一條重要途徑。

大孔樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的有機高分子聚合物吸附劑，其操作條件溫和、載量大、選擇性好、易解吸，它在天然產(chǎn)物的分離、抗生素的純化、生化藥物研究及其他領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用［11-12］。Gao等［13］用大孔樹脂從傳統(tǒng)中藥細辛中分離到黃芩苷。Zhang等［14］利用大孔樹脂從竹葉的抗氧化物中分離到4種黃酮碳苷類化合物。國外應(yīng)用大孔樹脂分離、濃縮、純化微生物藥物，包括目前已知的各類抗生素［15-16］。

研究表明，樹脂的孔徑、比表面積、被分離物質(zhì)以及樹脂的極性是影響樹脂吸附能力的重要因素［17］。本試驗中，CAD-40的孔徑及比表面積均小于X-5和AB-8，然而CAD-40屬于中極性，X-5和AB-8分別屬于非極性和弱極性，相同條件下，CAD-40型樹脂的吸附率顯著高于X-5、AB-8型樹脂，這表明011發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分為極性較強的物質(zhì)。大孔樹脂具有一定的吸附飽和度，上樣量低于或高于此值，會造成樹脂或樣品浪費。本試驗中，當(dāng)上樣量為樹脂質(zhì)量的15倍時，CAD-40達到吸附飽和。解吸劑能使大孔樹脂溶脹，減弱樹脂與被吸附物質(zhì)之間的吸附力。常用的解吸劑有低級醇、酮及其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮［18］。本試驗中，相同條件下，乙醇的相對解吸率顯著高于甲醇和丙酮，且考慮生產(chǎn)安全性，本試驗選擇乙醇作為解吸劑。70%的乙醇相對解吸率為96.7%，低于或高于此值，解吸率均下降，因此選用70%的乙醇作為解吸劑。p H為7時，CAD-40型樹脂解吸率最高，p H升高或降低其解吸能力均下降。這表明，中性條件利于011活性物質(zhì)的解吸。

本試驗以辣椒疫病菌為指示菌，用大孔樹脂對011菌發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)進行了初步靜態(tài)吸附和解吸研究，而對于活性成分的分離尚需結(jié)合硅膠色譜和HPLC等多種色譜手段，以期獲得新型高效的抗菌化合物。

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中圖分類號：S 476.8

文獻標(biāo)識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.009

收稿日期：2013-12-24

修訂日期：2014-01-23

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31071738，31000827）；湖南省教育廳重點項目（10A051）；湖南省自然科學(xué)基金項目（09JJ-3032）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)穩(wěn)定人才科學(xué)基金項目（07WDI8）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2013B310）；長沙市科技局項目（K1308044-21）

*通信作者E-mail：yiyoujin＠163.com

Adsorption and desorption characteristics of macroporous resins to antifungal substances in the fermentation broth of endophytic bacterium 011

Zhou Jinwei1，2， Yi Youjin1，2， Bo Lianyang3， Cao Xi1，2， Tian Jian1，2， Cheng Yuandu1，2
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China；3.College of Bio-Safety Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

AbstractEndophytic bacterium 011，isolated from healthy tobacco stem，had strong inhibitory effects on plant pathogenic fungi.In order to clarify its antifungal ingredients and establish adsorption and desorption conditions of bioactive substances，three types of macroporous resins X-5，AB-8 and CAD-40 were used to determine the effects of resin type，sample weight，desorption reagent，desorption reagent volume fraction and p H on the adsorption and desorption of bioactive substances.The results showed that CAD-40 exhibited the best adsorption and desorption capacity to bioactive substances，and the optimum static adsorption conditions were as followed：fermentation broth was loaded with 15 times of resin mass，and 70%ethanol was used as eluent with p H of 7 as eluent.

Key wordsendophyte； antifungal activity； macroporous resin； adsorption rate； desorption rate