張 穎， 王光函， 趙 玥， 吳 怡， 鄒桂欣

（遼寧省中醫(yī)藥研究院， 遼寧 沈陽 110034）

紫癜顆粒有效組分定量測定

張 穎*， 王光函， 趙 玥， 吳 怡， 鄒桂欣

（遼寧省中醫(yī)藥研究院， 遼寧 沈陽 110034）

目的 建立紫癜顆 粒 的 定量 分 析 方 法。 方 法 采 用 HPLC-ELSD法測 定 制 劑 中 黃 芪 甲 苷， 使 用 Kromasil C18（4.6 mm×200 mm， 5 μm） 色 譜 柱， 以 乙 腈-水 （ 36 ∶64） 為 流 動 相， 體 積 流 量 1.0 mL/min， 柱 溫 25 ℃， Alltech 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器 （漂移管溫度 105 ℃； 載氣體積流量 3.0 L/min）； 采用 HPLC-DAD法測定制劑中蘆薈大黃素、 大黃酸、 大黃素、 大黃酚、 大黃素甲醚的量， 使用依利特 Hypersil BDSC18（4.6 mm×200 mm， 5 μm） 色譜柱，以甲醇-0.2%磷酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫， 體積流量 1.0 mL/min， 檢測波長 254 nm， 柱溫 25 ℃。 結(jié)果 黃芪甲苷、 蘆薈大黃素、 大黃酸、 大黃素、 大黃酚、 大黃素甲醚的線性范圍分別為 0.53 ～3.18 μg（r=0.999 3）， 5.15 ～51.5 ng（r=0.999 9）， 5.04 ～50.4 ng（r=1）， 9.68 ～96.8 ng（r=1）， 27.2 ～272 ng（r=1）， 2.68 ～26.8 ng（r= 1）； 平均回收率 （n=9） 為 95.6% ～104.5%， RSD為 0.2% ～2.6%。 結(jié)論 所建方法簡便、 準(zhǔn)確， 重復(fù)性好， 可作為此制劑的定量方法。

紫癜；黃芪甲苷；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚

紫癜顆粒是遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的協(xié)定方，由黃芪、酒大黃、太子參、阿膠和甘草等九味中藥組成。制備工藝如下：酒大黃乙醇提取，減壓干燥至干，粉碎；阿膠減壓干燥至干，粉碎；太子參等其余七味藥材加水提取，減壓干燥至干，粉碎，與酒大黃浸膏粉合并，以阿膠粉和適量糊精為底料， 采用 70%乙醇濕法制成顆粒。 經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐與藥理實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其能明顯提升外周血小板計數(shù)并有效控制特發(fā)性血小板減少性紫癜ITP出血癥狀， 可顯著改善因大量使用激素而致股骨頭壞死等并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對制劑的有效組分黃芪甲苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚進(jìn)行定量研究，為建立該制劑的質(zhì)量控制方法提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100 高效液相色譜儀： 四元泵、 DAD檢測器； Alltech-ES2000 檢測器。 黃芪甲苷、 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的對照品均購于中國藥品生物制品檢定所 （批號分別為110781-200613、 110795-201007、 110757-200206、110758-200110、 110796-201118 和 110758-201013 ）；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；其他試劑均為分析純；供試品由遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)室提供，批號分別為 20120801、 20120802、20120803。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的測定［1］

2.1.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 （4.6 mm× 200 mm， 5 μm）； 流動相為乙腈-水 （36 ∶64）；體積流量 1.0 mL/min， 柱溫 25 ℃， 蒸發(fā)光散射檢測器 （ 漂 移 管 溫 度 105 ℃； 載 氣 體 積 流 量 3.0 L/min）。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對照品溶液 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定， 加甲醇制成每 1 m L含 0.106 mg的溶液，即得。

2.1.2.2 供試品溶液 取裝量差異項下的本品，研細(xì)， 取5 g， 精密稱定， 置索式提取器中， 加甲醇100 mL， 加熱回流 2 h， 提取液蒸干， 殘渣加水50 mL， 微熱使溶解， 用水飽和的正丁醇振搖提取4 次， 每次20 mL， 合并正丁醇液， 用氨試液洗滌3 次， 每次50 mL， 棄去氨試液， 再用正丁醇飽和水50 m L洗滌1 次， 棄去水洗液， 正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度， 搖勻， 濾過， 取續(xù)濾液， 過 0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例取藥材， 除去黃芪片，按工藝制備陰性樣品。 取陰性樣品5 g，按 “2.1.2.2” 項下制備陰性供試液。

2.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取陰性供試液、供試品溶液及黃芪甲苷對照品溶液，分別注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，見圖1。 結(jié)果表明： 陰性供試液色譜圖中，在與黃芪甲苷對照品相同保留時間處未見相應(yīng)色譜峰干擾，實(shí)驗(yàn)方法的專屬性良好。 理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于 4 500。

圖 1 黃芪甲苷 HPLC-ELSD色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatogram s for determ ination of astragaloside

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液 5、10、 15、 20、 25、 30 μL注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積對數(shù)為縱坐標(biāo) 進(jìn)行線 性回歸， 線性 方程為 Y=1.489X+ 2.962， r=0.999 3。 說明黃芪甲苷進(jìn)樣量在 0.53 ～3.18 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液 20 μL， 平行 6 次， 注入液相色譜儀中， 測定，黃芪甲苷對照品溶液峰面積的 RSD為1.1%， 精密度結(jié)果良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 分別在放置0、 3、 6、 12、 15、 18 h 時， 注入液相色譜儀中， 測定，計算， RSD為 3.5%， 說明供試品溶液在18 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為 20120801 的本品100 g， 研細(xì)， 取 5 g， 平行 6 份， 精密稱定， 按“2.1.2.2” 項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液 20 μL， 注入液相色譜儀中， 測定，計算，結(jié)果6份樣品中黃芪甲苷含有量均值為126.2 μg/g， RSD為 2.7%。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取批號為 20120801 的本品100 g，研細(xì)， 取 2.5 g， 平行 9 份，分 3 種濃度向樣品中分別加入黃芪甲苷對照品溶液，每個加標(biāo)樣品平行 3 份， 按 “2.1.2.2” 項下制備供試品溶液。 分別精密吸取供試品溶液各 20 μL， 測定，計算加樣回收率，結(jié)果黃芪甲苷平均回收率在98.2% ～103.3%之間， 變異系數(shù)在 0.8 ～1.6 之間，實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.9 樣品測定 取不同批號的本品 3 批樣品100 g，研細(xì)，取 5 g， 精密稱定，按 “2.1.2.2”項下制備供試品溶液，精密吸取各批號供試品溶液20 μL， 分別注入液相色譜儀中， 測定， 批號為20120801、 20120802、20120803 的 3 批樣品中黃芪甲苷的含有量分別為 126.2、 124.3 和 119.7 μg/g。

2.2 蘆薈大黃素、 大黃酸、 大黃素、 大黃酚和大黃素甲醚的測定［2］

2.2.1 色譜條件 依利特 Hypersil BDSC18色譜柱（4.6 mm×200 mm， 5 μm）； 以甲醇為流動相 A，0.2%磷酸溶液為流動相 B， 進(jìn)行梯度洗脫 （0 ～5 min， 28%B； 5 ～20 min， 28% ～8%B； 20 ～25 min， 8% ～28%B； 25 ～28 min， 28%B）；體積流量 1.0 mL/min， 柱溫 25 ℃， 檢測波長 254 nm。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液 取蘆薈大黃素、 大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、 大黃酚、 大黃素甲醚各 0.206 mg、 0.252 mg、 0.484 mg、 0.272 mg和 0.053 6 mg的溶液；分別精密量取上述對照品溶液適量， 置于同一10 mL量瓶中， 加甲醇至刻度，混勻， 即得 （每1 mL中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為 5.15 μg、 5.04 μg、 9.68 μg、 27.2 μg、2.68 μg）。

2.2.2.2 供試品溶液 取裝量差異項下的本品，研細(xì)， 取1 g， 精密稱定， 置錐形瓶中， 精密加入甲醇25 m L， 稱定質(zhì)量， 加熱回流 1 h， 放冷， 再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液 5 mL， 置燒瓶中， 揮去溶劑， 加8%鹽酸溶液 10 m L， 超聲處理 2 min， 再加三氯甲烷 10 m L， 加熱回流 1 h， 放冷， 置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL， 合并三氯甲烷液， 減壓回收溶劑至干， 殘渣加甲醇使溶解， 轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 搖勻， 濾過， 取續(xù)濾液， 過 0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例取藥材， 除去大黃片， 按工藝制備陰性樣品。 取陰性樣品5 g，按 “2.1.2.2” 項下制備陰性供試液。

2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取陰性供試液、供試品溶液及蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚混合對照品溶液，分別注入液相色譜儀中， 記錄色譜圖， 見圖2。 結(jié)果表明：陰性供試液色譜圖中，在與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品相同保留時間處未見有相應(yīng)色譜峰干擾，實(shí)驗(yàn)方法的專屬性良好。理論板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)不低于3 000。

圖2 蘆薈大黃素、 大黃酸、 大黃素、 大黃酚、大黃素甲醚 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s for determ ination of aloe emodin， rhein， emodin，chrysophanol and emodin methyl ether

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、 2、 4、 6、 8、 10 μL， 注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸， 線性方程分別為蘆薈大黃素 y=4.146x-1.145， r=0.999 9； 大黃酸 y=3.123x-1.822，r=1；大黃素 y=2.782x-1.480， r=1； 大黃酚y=4.057x-0.868 5， r=1； 大 黃 素 甲 醚 y= 14.92x-1.915， r=1。 表明蘆薈大黃素進(jìn)樣量在5.15 ～51.5 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；大黃酸進(jìn)樣量在5.04 ～50.4 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好； 大黃素進(jìn)樣量在 9.68 ～96.8 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好； 大黃酚進(jìn)樣量在 27.2 ～272 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；大黃素甲醚進(jìn)樣量在 2.68 ～26.8 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液 5 μL， 平行 6 次，注入液相色譜儀中， 測定， 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品 溶 液 峰 面 積 的 RSD 分 別 為 0.8%、 0.7%、0.6%、 0.5%和0.3%， 精密度結(jié)果良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在放置0、 3、 6、 12、 18 h 時，注入液相色譜儀中， 測定，計算， RSD分別為 2.8%、 1.9%、 1.5%、 2.9%和2.4%， 說明供試品溶液在18 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為20120801 的樣品50 g， 研 細(xì)， 取 1 g， 平 行 6 份， 精 密 稱 定， 按“2.2.2.2” 項下方法制備供試品溶液， 分別精密吸取供試品溶液 20 μL， 注入液相色譜儀中， 測定，計算，結(jié)果6份樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含有量均值分別為50.97、 59.12、 92.84、257.9 和 13.86 μg/g， RSD分別為 2.7%、 2.3%、 2.0%、 1.6%和 2.5%。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 取批號為 20120801 的本品50 g， 研細(xì)， 取0.5 g， 平行9 份， 分3 種濃度向樣品中分別加入蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品溶液，每個加標(biāo)樣品平行3份， 按 “2.2.2.2” 項下制備供試品溶液。 分別精密吸取供試品溶液各 20 μL， 測定， 計算加樣回收率，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率 （n=9） 分別在95.6% ～104.5% 之 間， RSD在 0.2% ～2.6% 之間。實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.9 樣品測定 取不同批號的本品 3 批樣品 50 g， 研細(xì)， 取 1 g， 精密稱定， 按 “2.2.2.2” 項下制備供試品溶液， 精密吸取各批號供試品溶液 20 μL，分別注入液相色譜儀中，測定， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

3 討論

黃芪是本品君藥，臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芪皂苷具有免疫調(diào)節(jié)［3］、 抗腫瘤［4］和改善心血管疾病等 廣 泛 的 生 物 活 性［5-6］， 是 本 品 的 有 效 成 分。《中國藥典》2010 年版一部黃芪藥材項下采用蒸發(fā)光散射法，建立了其含量測定方法。參照此方法，在樣品的提取過程中，本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計對黃芪甲苷的供試液制備進(jìn)行考察，通過比較，確定應(yīng)用甲醇為提取溶劑，索式提取法，水飽和正丁醇振搖提取4次，效果較好。

表1 樣品中蘆薈大黃素、 大黃酸、 大黃素、 大黃酚和大黃素甲醚測定結(jié)果 （μg·g-1）Tab.1 Con tent determ ination of aloe emodin， rhein， em odin， chrysophanol and emodin methyl ether in sam p les（ μg·g-1）

大黃藥材的主要成分是大黃素等蒽醌類化合物，各種動物實(shí)驗(yàn)證明，大黃能縮短凝血時間，降低毛細(xì)血管通透性，改善血管脆性，使纖維蛋白原增加，降低抗凝血酶Ⅲ的活性，使血管收縮活動增加， 促進(jìn)骨髓制造血小板， 因而促進(jìn)血液凝固［7］。大黃還可以影響微循環(huán)，促進(jìn)局部止血。止血有效成分是大黃酚、 大黃素甲醚等［8］。因此， 本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，對紫癜顆粒中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚定量測定方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：精密度、重復(fù)性及回收率實(shí)驗(yàn)均符合要求。

［1］ 李 爽，賈 媛，范 玲，等.芪葵顆粒定性定量方法研究［ J］.藥物分析雜志， 2012， 32（9） ： 1564-1569.

［ 2 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典： 2010 年版一部［S］.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 22.

［3］ 王庭欣，王庭祥，吳廣臣，等.黃芪多糖增強(qiáng)小鼠免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時珍國醫(yī)國藥， 2009， 20（7）： 1763-1764.

［4］ 楊 璐， 沈 洪.黃芪及其主要成分抗腫瘤免疫機(jī)制研究進(jìn)展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2011， 35（3）： 281-283.

［ 5 ］ 霍根紅.黃芪心血管藥理作用研究進(jìn)展［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2007， 22（1）： 86-88.

［ 6 ］ 郭 偉.中藥黃芪的藥理及臨床研究概況［J］.山西中醫(yī)，2011， 27（11）： 52-54.

［7］ 林聲在，張朝鳳，劉曉東，等.大黃、 虎杖、何首烏止血作用的比較研究 ［J］.西北藥學(xué)雜 志， 2012， 27 （6）：553-555.

［ 8 ］ 李 敏， 李麗霞， 劉 渝， 等.大黃研究進(jìn)展［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2006， 8（4）： 34-39.

Quantitative determ ination for efficient fractions of Zidian Granules

ZHANG Ying*， WANG Guang-han， ZHAO Yue， WU Yi， ZOU Gui-xin
（Liaoning Provincial Academy of Chinese Medicine， Shenyang 110034， China）

purpura； astragloside； aloe emodin； rhein；emodin； chrysophanol； emodin methyl ether

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0547-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.021

2013-04-19

國家科技重大專項課題 （2010ZX09401-304）

張 穎 （1979—） ， 女， 副研究員， 博士， 從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評價研究。 E-mail： xuanxuanzy@163.com