宋開娟， 廖長秀， 劉燕平， 陳湘蕓， 黃岑漢*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西 南寧 530001； 2.右江民族醫(yī)學(xué)院， 廣西 百色 533000）

羅漢果甜苷對體外人肝星狀細(xì)胞活化和凋亡的影響

宋開娟1， 廖長秀2， 劉燕平1， 陳湘蕓1， 黃岑漢2*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西 南寧 530001； 2.右江民族醫(yī)學(xué)院， 廣西 百色 533000）

目的 研究羅漢果甜苷對體外培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞 LX-2 活化及凋亡的影響。 方法 體外培養(yǎng) LX-2， 將其分為空白對照組、 不同質(zhì)量濃度的羅漢果甜苷干預(yù)組 （80、 160、 240、 320 μg/m L）， 每組 8 瓶細(xì)胞， 藥物與細(xì)胞共同孵育24 h 后， 采用 CCK-8 試劑檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)， 用酶聯(lián)免疫吸附法測定轉(zhuǎn)化生長因子-β1 （TGF-β1） 和Ⅰ型膠原的蛋白分泌， 用 RT-PCR法檢測 TGF-β1 和 α-平滑肌肌動蛋白 （α-SMA） 的 mRNA的表達(dá)。 用流式細(xì)胞儀雙染法檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果 CCK8 結(jié)果顯示羅漢果甜苷各劑量組作用 LX-2 細(xì)胞 24 h 后， 細(xì)胞增殖均明顯降低 （ P＜0.05）； ELISA和RT-PCR結(jié)果表明， 與空白對照組比較， 羅漢果甜苷各劑量組可抑制 LX-2 中 TGF-β1 和Ⅰ型膠原的蛋白分泌； 并能抑制 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA表達(dá) （P＜0.05）。 流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示羅漢果甜苷各劑量組亦可劑量依賴性顯著增加 LX-2 凋亡率。 結(jié)論 羅漢果甜苷可通過抑制 TGF-β1 和 I型膠原的蛋白及 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA的表達(dá)來抑制肝星狀細(xì)胞活化，還能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

羅漢果甜苷；肝星狀細(xì)胞；活化；凋亡

肝纖維化是肝硬化的早期病變，是由各種慢性肝病引起的慢性肝損傷。肝纖維化發(fā)生時，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異 常 增生， 細(xì)胞外 基 質(zhì) （extracellular matrix， ECM）的合成和降解失衡， 導(dǎo)致 ECM在肝內(nèi)過度沉積，其中肝星狀細(xì)胞的活化、增殖并轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞是 ECM的主要來源［1］。 羅漢果甜苷是羅漢果提取物的主要有效成分，主要藥理作用包括：祛痰、鎮(zhèn)咳、清除自由基及抗氧化活性、增強免疫、 抗癌［2］， 并且有研究證明其對大鼠及小鼠急慢性肝損傷有保護(hù)作用，具體作用機制尚不明確［3-5］。為進(jìn)一步探討羅 漢果甜苷抗肝纖維 化的作用機制， 本實驗采用 CCK8、 RT-PCR和 ELISA等方法，探討羅漢果甜苷對肝纖維化發(fā)生關(guān)鍵細(xì)胞——人肝星狀細(xì)胞 LX-2 活化和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝星狀細(xì)胞株 （LX-2） 購于中南大學(xué)湘雅中心實驗室細(xì)胞庫； 羅漢果甜苷 （其成分為羅漢果苷 V， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 63.49%， 含水分量為3.46%， 灰分為 0.79%）， 購于廣西桂林萊茵生物科技股份有限公司。 胎牛血清、 DMEM培養(yǎng)液購于 Gibco公司； CCK-8 試劑為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品； ELISA試劑盒購于上海拜沃生物科技公司； RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 Fermentas公司； SuperReal PreMix為天根公司產(chǎn)品。 細(xì)胞凋亡試劑盒購于凱基生物。 實時熒光定量 PCR儀和凝膠成像分析系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LX-2 置于含 10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基、5%CO2、37 ℃、 飽和濕度的條件下培養(yǎng)， 復(fù)蘇及傳代后次日換液，1～2 d換液，并密切觀察培養(yǎng)液顏色及細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞呈單層覆蓋瓶底時，用 0.25%的胰酶消化， 按照 1 ∶2 的比例傳代。

1.2.2 實驗分組及處理 空白對照組加入 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液； 用 10% 胎 牛血清 的DMEM培養(yǎng)液將羅漢果提取物稀釋成不同質(zhì)量濃度， 分別為 80、160、 240、 320 μg/mL。 待細(xì)胞60%融合， 更換為無血清培養(yǎng)基同步化24 h， 然后再加藥干預(yù) 24 h。

1.2.3 CCK-8 試劑檢測細(xì)胞活化 用 96 孔板培養(yǎng)細(xì)胞， 共分 5 組， 每組 10 孔細(xì)胞， 待藥物干預(yù) 24 h 后， 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液， 置 37 ℃恒溫振蕩箱孵育1 h， 在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1） 和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá) 根據(jù)藥物質(zhì)量濃度將實驗分為5組，每組8瓶細(xì)胞，將細(xì)胞加藥干預(yù)24 h 后， 收集每瓶細(xì)胞培養(yǎng)液上清于 1.5 mL EP管， 按照 TGF-β1 和Ⅰ型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明操作， 最后使用酶標(biāo)儀在 450 nm下讀取吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 RT-PCR法檢測 TGF-β1 和 α-平滑肌肌動蛋白 （α-SMA） mRNA的表達(dá) 藥物處理方法同前，設(shè)置5 個實驗組， 每組8 瓶細(xì)胞， 干預(yù)24 h后用Trizol裂解液將細(xì)胞裂解， 提取總 RNA； 用紫外分光光度法檢測總 RNA純度和濃度； 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。利用 Primer 5.0 設(shè)計其引物序列， β-actin 為內(nèi)參， 引物序列及產(chǎn)物長度見表 1。 反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性 15 min，95 ℃變性 10 s； 60 ℃變性 30 s共 45 個循環(huán)； 55℃ ～95 ℃， 每 30 s連續(xù)升溫檢測熒光值及擴增產(chǎn)物熔解曲線， 共 81 個循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后以 β-actin為參照物， 計算出各組 mRNA表達(dá)情況。

表 1 TGF-β1、 α-SMA和 β-actin引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 TGF-β1， α-SMA and beta actin primers sequences and the length of the product

1.2.6 流式細(xì)胞儀雙染法檢測細(xì)胞凋亡 設(shè)置為5組，每組3瓶細(xì)胞，按照實驗方法對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后， 棄培養(yǎng)液， 加入不含 EDTA胰酶消化后， 離心， 用 PBS 洗滌 細(xì) 胞 兩次， 加入 500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞， 加入 5 μL FITC混勻后， 再加入5 μL PI混勻， 室溫避光， 反應(yīng) 15 min 后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 試劑檢測細(xì)胞活化情況 細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞加入 CCK-8 試劑后 1 h， 可見培養(yǎng)液顏色變淺，且高質(zhì)量濃度組顏色較低質(zhì)量濃度組稍淺。80 ～320 μg/m L質(zhì)量濃度 OD值較空白組均有不同程度降低，隨著質(zhì)量濃度增高，對細(xì)胞增殖抑制明顯 （表2）。

表 2 不同質(zhì) 量 濃 度 羅 漢 果 甜 苷 對 抑 制 LX-2 活 化 的 影 響（n=10，）Tab.2 Influence on inhibiting LX-2 activation with different concentration mogroside（ n=10，）

表 2 不同質(zhì) 量 濃 度 羅 漢 果 甜 苷 對 抑 制 LX-2 活 化 的 影 響（n=10，）Tab.2 Influence on inhibiting LX-2 activation with different concentration mogroside（ n=10，）

注： 與空白對照組相比，*P＜0.05

組 別 劑量/（μg·mL-1） OD值 抑制率/%空白對照組 0.329 ±0.013—羅漢果甜苷組 80 0.305 ±0.008* 7.6羅漢果甜苷組 160 0.272 ±0.037* 17.4羅漢果甜苷組 240 0.228 ±0.032* 48.3羅漢果甜苷組 320 0.171 ±0.017*50.1

2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定 法檢測 LX-2 培養(yǎng)基中TGF-β1 及Ⅰ型膠原的蛋白分泌量 隨著羅漢果甜苷質(zhì)量濃度的增高其 TGF-β1 及Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)下降，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05） （見表 3）。

表 3 羅漢果甜苷對 LX-2 中Ⅰ型膠原及 TGF-β1 的蛋白表達(dá)影響 （n=8，）Tab.3 Expression influence on collagenⅠ and TGF-β1 protein with mogroside in LX-2 （ n=8，）

表 3 羅漢果甜苷對 LX-2 中Ⅰ型膠原及 TGF-β1 的蛋白表達(dá)影響 （n=8，）Tab.3 Expression influence on collagenⅠ and TGF-β1 protein with mogroside in LX-2 （ n=8，）

注： 與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別 劑量/（ μg·m L-1）Ⅰ型膠原/（pg·mL-1）TGF-β1/（pg·m L-1）空白對照組17.264 ±0.591 42.261 ±0.991羅漢果甜苷組 80 16.693 ±0.519*32.925 ±0.899*羅漢果甜苷組 160 15.851 ±0.411*24.791 ±0.804**羅漢果甜苷組 240 15.418 ±0.367*20.505 ±0.768*羅漢果甜苷組 320 13.781 ±0.879*18.339 ±0.892*

2.3 RT-PCR法檢 測 TGF-β1 及 α-SMA mRNA的表達(dá) LX-2 經(jīng)羅漢果甜苷作用 24 h 后， TGF-β1 的mRNA表達(dá)呈下降趨勢 （見表 4）， 其中 80 μg/mL及 160 μg/mL藥物質(zhì)量濃度干預(yù)后與空白對照組比較無明顯差異 （P＞0.05）， 后兩組藥物質(zhì)量濃度與空白對照組比較有明顯差異 （P＜0.05）。 α-SMA的 mRNA表達(dá)呈下降趨勢， 320 μg/mL藥物質(zhì)量濃度組與空白對照組比較有明顯差異 （P＜0.05）。

表 4 羅 漢果甜 苷 對 LX-2 中 TGF-β1 和 α-SMA的 m RNA的表達(dá)影響 （n=8，）Tab.4 Influence on TGF-β1 andα-SMA m RNA exp ression w ith mogroside in LX-2 （ n=8，）

表 4 羅 漢果甜 苷 對 LX-2 中 TGF-β1 和 α-SMA的 m RNA的表達(dá)影響 （n=8，）Tab.4 Influence on TGF-β1 andα-SMA m RNA exp ression w ith mogroside in LX-2 （ n=8，）

注： 與空白對照組比較，*P＜0.05

組 別 劑量/（ μg·m L-1）TGF-αβ12-ΔΔCT值SMA2-ΔΔCT值1.074 ±0.451 1.019 ±0.244羅漢果甜苷組 80 0.907 ±0.443 0.742 ±0.443羅漢果甜苷組 160 0.678 ±0.167 0.753 ±0.418羅漢果甜苷組 240 0.430 ±0.414* 0.790 ±0.127羅漢果甜苷組 320 0.426 ±0.254* 0.353 ±0.181空白對照組*

2.4 流式細(xì)胞儀雙染法檢測細(xì)胞凋亡 結(jié)果顯示，與空白對照組比較， 羅漢果甜苷組作用于 LX-2 24 h， 細(xì)胞凋亡率增加， 且有顯著性差異 （P＜0.05）， 其凋亡率隨羅漢果甜苷質(zhì)量濃度增高而升高，見表5。

3 討論

近年來研究表明，在正常肝臟內(nèi)，LX-2 處于靜止?fàn)顟B(tài)， 當(dāng) LX-2 受到炎性細(xì)胞因子等病理因素刺激后，活化并大量增殖，其活化和功能改變是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵。 在 LX-2 激活 的持續(xù)階段，LX-2 出現(xiàn)很多表型變化， 包括增殖、 收縮、 基質(zhì)降解、纖維形成、維生素A缺乏和細(xì)胞因子釋放等。 其中 TGF-β1 是最重要的促肝纖維化細(xì)胞因子［6-7］，它具 有 活 化 LX-2、促 進(jìn) 膠 原 纖 維 和 ECM的合成及沉積等多種作用。 而反映 LX-2 的活化和向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的標(biāo)志指標(biāo)為 α-SMA［8］， 其表達(dá)量的多少可用來衡量肝星狀細(xì)胞的激活程度［9-10］， 隨著肝 星狀 細(xì) 胞 培養(yǎng) 活 化 α-SMA表 達(dá) 逐步增加［11］。 同時激活的 LX-2 合成大量的以Ⅰ、 Ⅲ型膠原為主的 ECM［12］，其中Ⅰ型膠原增多最為顯著。 Ⅰ型膠原可促進(jìn) LX-2 激活、增殖，并抑制肝細(xì)胞及竇內(nèi)皮細(xì)胞的增生，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。因此阻斷細(xì)胞因子促增殖的作用，將成為治療肝纖維化的有效手段。

表 5 羅漢果甜苷對 LX-2 凋亡的影響 （n=3，）Tab.5 Influence on the LX-2 apoptosis w ith mogroside（n=3，）

表 5 羅漢果甜苷對 LX-2 凋亡的影響 （n=3，）Tab.5 Influence on the LX-2 apoptosis w ith mogroside（n=3，）

注： 與空白對照組相比，*P＜0.05

組 別 劑量/（μg·m L-1） 凋亡率/%空白對照組 —1.97 ±0.15羅漢果甜苷組 80 7.70 ±0.30*羅漢果甜苷組 160 10.16 ±0.23*羅漢果甜苷組 240 14.33 ±0.25*羅漢果甜苷組 320 16.53 ±0.41*

近年來研究證實，羅漢果甜苷除具有祛痰、止咳、 潤腸通便［13］等作用外， 經(jīng)過實驗還證實其有阻止肝細(xì)胞脂肪變性［14］， 并對肝纖維化大鼠有保護(hù)作用［15］， 但在該藥對 LX-2 的基因和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用還未見報道， 因此本實驗運用 RT-PCR、ELISA、 流式細(xì)胞術(shù)等方法， 檢測羅漢果甜苷對LX-2 中 TGF-β1、 Ⅰ型膠原的蛋白及 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA表達(dá)的影響及細(xì)胞凋亡情況， 結(jié)果表明， 隨藥物質(zhì)量濃度增高， 藥物對 LX-2 的活化抑制作用增強， LX-2 中 TGF-β1， α-SMA和Ⅰ型膠原的蛋白及 mRNA的表達(dá)下降， 并且細(xì)胞凋亡呈下降趨勢， 這說明羅漢果甜苷可以抑制 LX-2 中TGF-β1， Ⅰ型膠原的蛋白分泌； 并能抑制 TGF-β1和 α-SMA、 的 mRNA的表達(dá)， 還能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制 LX-2 中 ECM的合成， 發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

［ 1 ］ Friedman SL.Evolving challenges in hepatic fibrosis［ J］ .Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2010， 7（8）： 425-436.

［ 2 ］ 李今玉， 金松竹.羅漢果的臨床應(yīng)用［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011， 27 （21）： 3286-3287.

［3］ 肖 剛，王 勤.羅漢果甜苷對小鼠實驗性肝損傷保護(hù)作用的研究［J］.中國藥房， 2008， 9（3）： 163-165.

［4］ 姚績偉，唐 暉，周 亮，等.羅漢果提取液對小鼠運動耐力及肝組織抗氧化損傷的影響［J］.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2008， 27（2）： 221-223.

［5］ 王 勤，肖 剛.羅漢果甜苷對大鼠慢性肝損傷保護(hù)作用的實驗研究［J］.廣西中醫(yī)藥， 2007， 30（5）： 54-56.

［6］ 郭 敏，李佃貴.化濁解毒含藥血清對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志， 2012，18（15）： 263-266.

［7］ 劉 蓮，葉立紅，康海燕，等.慢性乙型肝炎患者肝組織TGF-β1 和 Leptin 表達(dá)及與肝纖維化相關(guān)研究［ J］ .現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2012， 21 （35）： 3899-3940.

［ 8 ］ Cheng JH， She H， Han Y P， et al.Wnt antagonism inhibits hepatic stellate cell activation and liver fibrosis［ J］ .Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol， 2008， 294（1） ： G39-G49.

［9］ 陳達(dá)凡， 李建英， 鄭偉達(dá)， 等.外源性轉(zhuǎn)化生長因子 β1對大鼠原代肝星狀細(xì)胞活化的影響［J］.世界華人消化雜志， 2007， 15（3）： 211.

［10］ 陽丹才讓， 鄧 勇， 任 利， 等.硫化氫在大鼠肝星狀細(xì)胞氧應(yīng)激中對 α-SMA與細(xì)胞周期影響的實驗研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2010， 10（12）： 2205-2208.

［11］ 李志剛， 楊晉翔， 張 偉， 等.肝心寧對大鼠肝纖維化 α-SMA， MMP-13 及 TIMP-1 蛋白表達(dá)的 影響 ［ J］ .北京 中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報： 中醫(yī)臨床版， 2009， 16（5）： 6-9.

［12］ 林 紅， 黃玉紅， 李異玲.抗纖復(fù)方 I號對乙醛刺激的肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子分泌的干預(yù)作用［J］.世界華人消化雜志， 2011， 19（17）： 1826-1829.

［13］ 陳 瑤， 王永祥， 范小兵， 等.羅漢果甜苷的潤腸通便和抗炎作用研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報， 2011， 27 （3）：202-204.

［14］ 陳 薇， 段小群， 劉永明， 等.羅漢果甜苷對體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥， 2010， 21（12）：3092-3094.

［15］ 肖 剛， 陳 壯， 黎為能， 等.羅漢果甜苷對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的保護(hù)作用［ J］.山東醫(yī)藥， 2012， 52（16）： 19-24.

Effect of activation and apoptosis ofmogroside on hepatic stellate cell

SONG Kai-juan1， LIAO Zhang-xiu2， LIU Yan-ping1， CHEN Xiang-yun1， HUANG Cen-han2*
（1.Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China； 2.Youjiang Medical College for Nationalities， Baise533000， China）

mogroside； hepatic stellate cell； activation；apoptosis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0481-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.008

2013-06-12

廣西科技攻關(guān)課題 （0992003A-12； 0898001）； 國家自然科學(xué)基金 （81060040）

宋開娟 （1982—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中醫(yī)診法與辨證規(guī)范化客觀化。 E-mail： songkaijuan@163.com

*通信作者： 黃岑漢 （1959—） ， 男， 教授， 研究方向： 中醫(yī)診法與辨證的規(guī)范化客觀化及民族醫(yī)藥。 E-mail： hchgx@sina.com