盧海嘯， 李家洲， 鄭玉華， 倪 林

（廣西玉林師范學(xué)院， 廣西 玉林 537000）

烏蕨對(duì)樂(lè)果急性中毒的解毒活性研究

盧海嘯， 李家洲， 鄭玉華， 倪 林

（廣西玉林師范學(xué)院， 廣西 玉林 537000）

目的 研究烏蕨對(duì)解救樂(lè)果急性中毒的活性部位。方法 采用樂(lè)果中毒小鼠模型，觀察烏蕨不同提取物對(duì)樂(lè)果急性中毒的解救效果，測(cè)定烏蕨對(duì)中毒小鼠的乙酰膽堿酯酶活性的影響和存活率。結(jié)果 烏蕨水提部位組能提高小鼠的存活率； 并能顯著提高乙酰膽堿酯酶的活力 (P＜0.01)。 結(jié)論 烏蕨水提部位能改善小鼠的中毒癥狀， 提高小鼠的存活率和乙酰膽堿酯酶的活力。

烏蕨；解毒；活性部位

烏蕨 為 鱗 始 蕨 科 Lindsaeaceae烏 蕨 屬 Stenoloma 植 物，又名大葉金花草［1-2］。 烏蕨在民間有 “ 萬(wàn)能解毒藥” 之稱，廣泛用于解食物和農(nóng)藥中毒，還用于治瘡毒、毒蛇咬傷等［3-4］。 研究表明， 烏蕨水 提 物的 70%乙醇 溶 解 物可使砷中毒的小鼠死亡 率顯著降低， 并能提高其 耐受性［5］。 此外，烏蕨還能防治四氯化碳肝損傷作用，并能降低血清中ALT、 MDA水平， 升高 SOD酶活性和抗氧化能力［6-8］。 據(jù)報(bào)道， 烏蕨湯能很好的治療慢性腎衰， 療效確切［9］。 林向東［10］用單味草藥烏蕨治療下肢頑固性潰瘍 50 余例， 均取得良好療效。關(guān)于烏蕨解救有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的活性部位的研究，目前尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討其醇提物解救有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的活性部位及其對(duì)乙酰膽堿酯酶活力的影響，為篩選新的有機(jī)磷農(nóng)藥解毒劑提供一定的藥效學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠， 雌雄各半， 體質(zhì)量 (20 ± 4)g， 購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 清潔級(jí)， 許可證號(hào):SCXK桂 2009-0002。

1.2 藥物及試劑 烏蕨采于廣西欽州市浦北縣白石水鎮(zhèn)陳依村，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院劉壽養(yǎng)教授鑒定為陵始蕨科植物烏蕨 Stenoloma chusanum(Linn.)Ching in Sinensia。 采 后 粉碎， 60℃烘干備用； 樂(lè)果乳液 (廣東汕頭市西隴化工廠)、阿托品溶液 (山東新華制藥股份有限公司)、 碘解磷定溶液 (哈爾濱宏達(dá)動(dòng)物藥品廠)、 氯化乙酰膽堿 (北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。 所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 HH-s數(shù)顯恒溫水浴鍋 (江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)； U1901 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京譜析科學(xué)儀器有限公司)； RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)； SHZ-D(Ⅲ) 循環(huán)水式真空泵 ( 鞏儀市予華儀器有限責(zé)任公司)； 電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)等。

2 方法

2.1 烏蕨提取物的制備 稱取 300 g烏蕨干草， 加入6 000 mL 65%乙醇， 加熱回流1 h， 用四層紗布過(guò)濾， 得到提取液。重復(fù)提取4次，合并提取液，減壓回收溶劑，得膏狀提取物，即粗提物。將所得粗提物分散于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、水部分。再將各部分分別減壓回收溶劑，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、水部位。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將 100 只小鼠進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定，計(jì)算每只小鼠的乙酰膽堿酯酶活力，剔除差異較大的， 選取60只按乙酰膽堿酯酶活力分層， 再按隨機(jī)數(shù)字表分為6組 (空白對(duì)照組、 模型組、 陽(yáng)性對(duì)照組、 石油醚部位組、 乙酸乙酯部位組、 水部位組)， 每組 10 只。 實(shí)驗(yàn)前，將所有實(shí)驗(yàn)用的小白鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)1周，使其熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境，自由飲水和取食。

2.3 烏蕨不同提取部位對(duì)樂(lè)果中毒小鼠的活性篩選 實(shí)驗(yàn)組 (模型組、 陽(yáng)性對(duì)照組、 石油醚部位組、 乙酸乙酯部位組、 水部位組) 通過(guò)灌胃給予樂(lè)果溶液 (45 mg/kg)， 空白對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水。

上述操作結(jié)束后立即給藥解救，烏蕨石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、 水部位組 (給藥量均為 100 mg/kg)， 陽(yáng)性對(duì)照組每只小鼠立即靜脈注射按 1 mg/kg的阿托品溶液和按 75 mg/kg的碘解磷定溶液， 30 min 后， 進(jìn)行尾靜脈取血，備用。最后記錄小鼠的死亡率。

2.4 烏蕨水提物對(duì)樂(lè)果中毒小鼠的影響 將 100 只小鼠進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定，計(jì)算每只小鼠的乙酰膽堿酯酶活力， 剔除差異較大的， 選取60只按乙酰膽堿酯酶活力分層， 再按隨機(jī)數(shù)字表分為6組 (空白對(duì)照組、 模型組、 陽(yáng)性對(duì)照組、 水部位低劑量組 (100 mg/kg)、 水部位中劑量組 (150 mg/kg)、 水部位高劑量組 (300 mg/kg)， 每組 10只。 按表3～4分組和灌胃給藥， 其中空白對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水， 按 “2.3” 項(xiàng)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 記錄小鼠的死亡率。

2.5 乙酰膽堿酯酶活力的測(cè)定 采用乙酰膽堿酯酶試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

按下式計(jì)算酶活性的絕對(duì)值:

式中:Xs——水解乙酰膽堿的活力； A——樣品管的吸光度值； B——對(duì)照管的吸光度值； C——標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值。2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用 (-) 表示， 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析法進(jìn)行分析， 組間比較用 t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 小鼠的死亡率 結(jié)果如表 1、 表 2 所示， 陽(yáng)性對(duì)照組和水部位組的小鼠死亡率與模型組比差別很明顯。水部位的高劑量組的死亡率最低，水部位組的死亡率與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。說(shuō)明烏蕨的水部位具有明顯的解毒作用。該部位應(yīng)為烏蕨的抗樂(lè)果中毒的活性部位。且水部位組的死亡率隨劑量的增大而降低。

表1 小鼠的死亡率

表2 水部位不同劑量小鼠的死亡率

3.2 試驗(yàn)前后小鼠血液膽堿酯酶活力的變化 結(jié)果如表3、 4所示， 給藥后各組的酶活力與空白對(duì)照組相比有不同程度的提高 (P＜0.05)， 陽(yáng)性對(duì)照組、 烏蕨水部位組與模型組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。 故烏蕨的解毒活性部位應(yīng)該為烏蕨水部位。

烏蕨水部位的不同劑量組的酶活力與陽(yáng)性對(duì)照組、模型組、 空白對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)， 且隨著劑量的增大呈現(xiàn)出一定的線性關(guān)系。烏蕨水部位低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其藥效強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照組相近 (P＞0.05)。 而中高劑量組的藥效強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組 (P＜0.01)。

表3 烏蕨不同提取部位對(duì)小鼠血液膽堿酯酶活力的影響（s， n=10）

表3 烏蕨不同提取部位對(duì)小鼠血液膽堿酯酶活力的影響（s， n=10）

注: 與空 白對(duì)照組相 比，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比，●P＜0.05，●●P＜0.01； 與陽(yáng)性對(duì)對(duì)照組比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 與水部位組比，○P＜0.05，○○P＜0.01

組 別藥物劑量/(mg·kg-1)給藥前給藥后空白對(duì)照組—13.59±0.2813.86±0.29●●▲▲○○模型組4513.37±1.8012.54±0.35**▲▲○○陽(yáng)性對(duì)照組1.00(阿托品)、75.0(碘解磷定)14.05±0.8915.43±0.19●●**石油醚部位組10014.21±0.8713.65±0.39**▲▲○○乙酸乙酯部位組10013.67±0.8112.84±0.41*▲▲○○水部位組10014.09±0.4915.27±0.36**●●

表 4 烏蕨水部位對(duì)小鼠血液膽堿酯酶活力的影響 （ˉ，n=10）

表 4 烏蕨水部位對(duì)小鼠血液膽堿酯酶活力的影響 （ˉ，n=10）

注: 與空白 對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模 型組比，●P＜0.05，●●P＜0.01； 與 陽(yáng) 性 對(duì) 照 組 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別藥物劑量/(mg·kg-1)給藥前給藥后空白對(duì)照組—13.59±0.2813.87 ±0.31●●▲▲模型組45.013.37 ±1.8012.57 ±0.39**▲▲陽(yáng)性對(duì)照組1.00(阿托品)、75.0(碘解磷定)14.05 ±0.8915.48 ±0.21**●●水部位低劑量組10014.09 ±0.4915.40 ±0.30**●●水部位中劑量組15013.40 ±1.4515.81 ±0.35**●●▲水部位高劑量組30014.09±0.7615.97 ±0.56**●●▲▲

4 討論

樂(lè)果為有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥，是難逆膽堿酯酶抑制劑。目前，有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥中毒主要是采用膽堿酯酶復(fù)活藥和阿托品解救。但膽堿酯酶復(fù)活藥使酶復(fù)活的效果因不同的有機(jī)磷酸酯類而異，一般來(lái)說(shuō)，它對(duì)內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、對(duì)硫磷中毒的療效好，對(duì)敵百蟲(chóng)、敵敵畏中毒有一定的療效，而對(duì)樂(lè)果中毒幾乎無(wú)效。原因是樂(lè)果中毒所形成的磷?；憠A酯酶比較穩(wěn)定，幾乎是不可逆的，加以樂(lè)果乳劑含有苯，可能同時(shí)有苯中毒。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，烏蕨水部位可明顯降低樂(lè)果致小鼠急性中毒的死亡率，提高血液膽堿酯酶的活力。 烏蕨水部位的低劑量 (100 mg/kg) 的藥效強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)， 而中劑量 (150 mg/kg)、 高劑量(300mg/kg) 的藥效強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組。 其可能的解毒機(jī)理如下:①烏蕨水部位和樂(lè)果迅速結(jié)合，從而影響樂(lè)果的吸收，阻止樂(lè)果與乙酰膽堿酯酶的結(jié)合，防止樂(lè)果在體內(nèi)形成毒性更強(qiáng)的氧化樂(lè)果，加速樂(lè)果在體內(nèi)的消除。②烏蕨水部位和苯結(jié)合，阻止苯的吸收并加速苯在體內(nèi)的消除。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)烏蕨的化學(xué)成分的研究表明，烏蕨主要含有黃酮類、 有機(jī)酸等化學(xué)成分［11-15］， 黃酮類化 合物具有明確的抗氧化能力，而烏蕨的解毒作用是否與其有關(guān)，尚不得而知。至于烏蕨水部位具體的解毒活性成分及具體的解毒機(jī)制，本課題組正在進(jìn)行相關(guān)的研究中。

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R285.5

:B

:1001-1528(2014)02-0390-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.040

2013-02-23

玉林師范學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目 (2011YJZD18)

盧海嘯 (1974—)， 男， 講師， 博士， 主要從事中藥與天然藥物活性成分及藥效篩選的研究工作。 Tel:15907758504， E-mail:luhaixiao76@163.com