郜紅利， 涂 星， 盧 映， 張 方

（1.湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院， 湖北 恩施 435500； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 廣東 廣州 510006； 3.恩施自治州優(yōu)撫醫(yī)院， 湖北 恩施 445000）

［科研報(bào)道］

土家苗藥夜關(guān)門對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性失眠的療效觀察與機(jī)制初探

郜紅利1， 涂 星2， 盧 映2， 張 方3

（1.湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院， 湖北 恩施 435500； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 廣東 廣州 510006； 3.恩施自治州優(yōu)撫醫(yī)院， 湖北 恩施 445000）

目的 探討土家苗藥夜關(guān)門對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性失眠的藥效作用，并進(jìn)行初步的機(jī)理研究。方法 以對(duì)氯苯丙氨酸誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)型完全失眠小鼠模型，分為正常組、模型組、高、中、低劑量給藥組、安定組，分別給予相應(yīng)藥物，觀察小鼠一般行為學(xué)特征； 取腦組織， 測(cè)定超氧化物歧化酶 SOD及 NO水平。 結(jié)果 不同劑量的夜關(guān)門均能顯著性減少模型小鼠 3 min 內(nèi)活動(dòng)次數(shù)、 改善體表特征、 降低其腦組織中 NO的水平 (P＜0.05)； 中、 高劑量夜關(guān)門提取液能顯著性降低失眠小鼠腦組織中過高的 SOD水平 (P＜0.05)， 與安定無(wú)顯著性差異， 高劑量組可使過高的 SOD水平恢復(fù)至正常水平。結(jié)論 夜關(guān)門對(duì)對(duì)氯苯丙氨酸誘導(dǎo)的失眠小鼠具有較好的治療作用，該作用可能是通過降低其腦組織中 NO和SOD的水平實(shí)現(xiàn)的。

夜關(guān)門；對(duì)氯苯丙氨酸；睡眠剝奪；一氧化氮；超氧化物歧化酶

失眠 (insomnia) 是指患 者對(duì)睡眠時(shí) 間和 ( 或) 睡眠質(zhì)量不滿足并影響白天社會(huì)功能的一種主觀體驗(yàn)，目前常用苯二氮卓類和非苯二氮卓類催眠藥物進(jìn)行治療，但易產(chǎn)生不良反應(yīng)或戒斷綜合征［1］。 持續(xù)的覺醒或睡眠剝奪作為一種急性氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體免疫、內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)有明顯影響，尤其對(duì)腦功能的影響十分顯著，已有實(shí)驗(yàn)證明，睡眠剝奪可出現(xiàn)腦氧化，而大量的自由基和 NO參與了腦神經(jīng)細(xì)胞的毒性損傷［2-3］。 土家苗藥夜關(guān)門具有 “ 晝開夜合”的生物節(jié)律現(xiàn)象，說(shuō)明其有安神入眠的作用，現(xiàn)代研究表明，其中發(fā)揮中樞抑制和鎮(zhèn)靜作用的成分可能是琥珀酸等［4，5］。 本研究擬 以睡眠剝 奪 小鼠模型 為 研 究 對(duì) 象， 考 察土家苗藥夜關(guān)門對(duì)失眠動(dòng)物的影響，為其安神入眠作用提供合理的依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物與分組 健康 SPF級(jí) SD小鼠 60 只， 體質(zhì)量(200 ±20)g， 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 許可證號(hào) SCXK(粵)2013-0020。 將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組 (n=50) 和正常組 (n=10)。 每只小鼠均在相同條件下，自由飲水、攝食，保持自然光節(jié)律。

1.2 試劑及藥物 對(duì)氯苯丙氨酸， 購(gòu)于美國(guó) Sigma公司；NO、 SOD試劑盒， 購(gòu)于南京建成生物制劑研究所； 夜關(guān)門，采集于湖北省恩施州利川市佛寶山自然森林保護(hù)區(qū)，經(jīng)湖北民族學(xué)院朱敏英教授鑒定為豆科植物截葉鐵掃帚Lespedeza cuneata(Dum.Cours.)G.Don 的全草； 其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備 UV-7504 紫外可見分光光度計(jì) ( 上海欣茂儀器有限公司)； 微量有機(jī)分析專用超純水機(jī) (伊洋企業(yè)發(fā)展有限公司)； 小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀 (成都泰盟科技有限公司)； Anke TGL-16B離心機(jī)； JK5200B超聲波清洗器；分析天平等。

1.4 藥液的配制 對(duì)氯苯丙氨酸液配制: 精密稱取對(duì)氯苯丙氨酸3.000 0 g， 加弱堿性生理鹽水 (pH7 ～8) 溶解并定容至 100 mL， 即得 30 mg/mL的對(duì)氯苯丙氨酸混懸液。

夜關(guān)門水煎液: 稱取夜關(guān)門粗粉約 2 000 g， 加 6 倍水煎煮3次， 每次 1 h， 合并煎液， 濃縮至含生藥量為1 g/mL， 即得夜關(guān)門水煎液， -4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及給藥 模型組小鼠于每天上午 8:00 ～8:30按 10mL/kg用量腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸液， 正常組小鼠同時(shí)間等量腹腔注射弱堿性生理鹽水 (pH7 ～8)， 連續(xù)2 d。 動(dòng)物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失， 白天也活動(dòng)不停， 整體觀察與正常對(duì)照組有明顯不同，表明模型復(fù)制成功，剔除不成功的動(dòng)物模型。 選取失眠模型動(dòng)物40只， 分為模型對(duì)照組、高、中、低劑量給藥組及安定組，每組8只。

于第3 天開始每天上午8:00 開始， 參照參考文獻(xiàn) ［6］設(shè)定夜關(guān)門高、 中、 低劑量分別為 12.3、 6.15、 3.1 mL/kg (夜關(guān)門成人日用劑量為 30 g， 其小鼠臨床等效劑量為6.15 g/kg)， 安定組 3.1 g/kg灌胃給藥， 模型對(duì)照組和正常組給予同體積生理鹽水， 每天1次， 連續(xù)灌胃7 d。

2.2 動(dòng)物一般行為學(xué)觀察 末次給藥后， 觀察比較各組小鼠的體表特征， 并進(jìn)行積分評(píng)分［7］。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn): ①精神狀態(tài)及對(duì)外界的刺激反應(yīng)；②眼睛眼裂變窄，嗜睡等；③面部、口鼻黏膜和爪；④食欲、體質(zhì)量和消瘦程度；⑤皮毛毛色和光澤。按照5個(gè)等級(jí)進(jìn)行積分，狀態(tài)好的5分，狀態(tài)差為1分， 共計(jì)25分。

在末次給藥1 h后，將小鼠放入自主活動(dòng)儀中，待小鼠適應(yīng) 5 min 后， 計(jì)數(shù) 并 打 印 3 min 內(nèi)站 立 次 數(shù)， 連 續(xù) 2次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 SOD、 NO水平的測(cè)定 將各組大鼠脫頸椎處死， 剪開頭骨，掀去顱骨，以生理鹽水洗凈后取出大腦，置于吸水紙上稱重，吸去多余的水分，稱取吸水紙質(zhì)量，兩者之差即為腦組織凈重， 置于 -80 ℃液氮中保存。

按照試劑盒說(shuō)明書， 采用黃嘌呤氧化還原法測(cè)試 SOD水平， 采用硝酸還原酶法測(cè)定大腦內(nèi)的 NO水平。

2.4 數(shù)據(jù)的處理與統(tǒng)計(jì) 采用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 所有檢測(cè)結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 (-) 表示， 組間比較采用 One-Way ANOVA檢驗(yàn)， 雙側(cè)檢驗(yàn)顯著性水平取 α =0.05。

3 結(jié)果

3.1 夜關(guān)門對(duì)小鼠一般行為學(xué)的影響 觀察發(fā)現(xiàn)， 各組小鼠的進(jìn)食、飲水、排便和毛色的變化無(wú)明顯差異，但模型組小鼠的眼裂變寬，精神躁動(dòng)，對(duì)外界的刺激產(chǎn)生的應(yīng)激增強(qiáng)，自主活動(dòng)加快，給藥后上述癥狀均能得到一定程度的緩解。見表1。

表 1 小鼠一般行為學(xué)特征變化分析 （ ˉ， n=8）

表 1 小鼠一般行為學(xué)特征變化分析 （ ˉ， n=8）

注: 與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05； 與安定對(duì)照組比較，▲P＜0.05

組 別3 min 內(nèi)小鼠活動(dòng)次數(shù)小鼠外觀評(píng)分正常對(duì)照組7.10 ±1.5224.50 ±0.53模型對(duì)照組31.13 ±3.44*▲14.63 ±1.19*▲夜關(guān)門低劑量組21.25 ±3.33*△▲15.63 ±1.3*▲夜關(guān)門中劑量組10.88 ±1.96*△▲20.13 ±1.5*△夜關(guān)門高劑量組15.13 ±3.04*△▲19.25 ±1.49*△▲安定陽(yáng)性對(duì)照組5.88 ±9.16△22.38 ±1.19*△

由該研究結(jié)果可以看出，給予夜關(guān)門不同劑量的提取液后， 均能顯著性減少模型大鼠 3 min 內(nèi)小鼠活動(dòng)次數(shù)(P＜0.05)， 但遠(yuǎn)不如給予安定所達(dá)到的治療效果。 對(duì)于小鼠體表特征的影響而言，不同劑量的夜關(guān)門與安定均能顯著改善對(duì)氯苯丙氨酸所引起的不良生理狀態(tài) (P＜0.05)， 且中劑量的夜關(guān)門提取液與安定的效果無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)。

3.2 夜關(guān)門對(duì)小鼠腦組織中 NO和 SOD的影響 由研究結(jié)果可知， 對(duì)氯苯丙氨酸能導(dǎo)致正常小鼠腦組織中 NO、 SOD水平顯著性升高 (P＜0.05)， 提示對(duì)氯苯丙氨酸可能是通過引起大鼠腦組織中該類物質(zhì)的變化而誘導(dǎo)小鼠失眠；不同劑量夜關(guān)門提取液均能顯著性降低失眠小鼠腦組織中NO水平 (P＜0.05)， 且兩者之間無(wú)明顯的量效關(guān)系； 中劑量和高劑量夜關(guān)門提取液能顯著性降低失眠小鼠腦組織中SOD水平 (P＜0.05)， 低劑量夜關(guān)門提取液對(duì) SOD的影響不顯著， 提示夜關(guān)門對(duì)失眠小鼠腦組織中 SOD水平的影響與給藥劑量之間存在這一定的量效關(guān)系。此外，研究結(jié)果顯示， 中、 高劑量夜關(guān)門提取液降低 SOD水平效果與安定無(wú)顯著性差異， 高劑量組可使失眠小鼠過高的 SOD水平恢復(fù)至正常水平。 見表2。

表 2 夜關(guān)門對(duì)小鼠腦組織中 NO 和 SOD水平的影響（ ˉ， n=8）

表 2 夜關(guān)門對(duì)小鼠腦組織中 NO 和 SOD水平的影響（ ˉ， n=8）

注: 與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05； 與安定對(duì)照組比較，▲P＜0.05

組 別NO/( μmol/gprot)SOD/(U/mgprot )正常對(duì)照組3.257 5 ±0.096 6 415.707 5 ±29.952 0模型對(duì)照組6.060 0 ±0.183 0*481.138 8 ±32.023 5*夜關(guān)門低劑量組5.162 5 ±0.151 4*△▲451.162 5 ±31.524 7夜關(guān)門中劑量組4.026 3 ±0.214 0*△▲431.411 3 ±9.432 5△夜關(guān)門高劑量組4.198 8 ±0.304 7*△▲417.495 0 ±21.169 3△安定陽(yáng)性對(duì)照組3.038 8 ±0.177 2△429.526 3 ±14.898 9△

4 討論

4.1 對(duì)氯苯丙氨酸誘導(dǎo)失眠模型是目前公認(rèn)的， 并廣泛應(yīng)用于 5-HT及其與其他遞質(zhì)之間關(guān)系研究的經(jīng)典動(dòng)物模型［6］， 目前研究表明， 對(duì)氯苯丙氨酸失眠模型與中醫(yī)心腎不交模型的病癥相似［8］。 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明， 夜關(guān)門對(duì)對(duì)氯苯丙氨酸誘導(dǎo)的失眠小鼠具有較好的治療作用，能減少其自主活動(dòng)以及對(duì)外界刺激的應(yīng)激性，提示夜關(guān)門可用于心腎不交所致失眠患者臨床干預(yù)。

4.2 一氧化氮是細(xì)胞與細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，作為第一信使和神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。現(xiàn)代研究表明， 剝奪睡眠會(huì)導(dǎo)致機(jī)體NO產(chǎn)生增多， 而 NO具有促進(jìn)睡眠的作用，能引起集體疲勞感和睡意。 NO可以通過 cGMP消除氧自由基， 保護(hù)腦細(xì)胞， 但過量的 NO可以轉(zhuǎn)化成為作用很強(qiáng)的氧自由基， 反而加重腦損傷［9］。 本研究結(jié)果表明， 對(duì)氯苯丙氨酸剝奪睡眠 48 h后， 大鼠腦內(nèi)NO水平升高， 而夜關(guān)門可以顯著降低NO的水平， 避免過量的NO加重腦損傷。

4.3 超氧化物歧化酶 (SOD) 是人體內(nèi)最重要的自由基清除劑。 現(xiàn)代研究表明， SOD可清除體內(nèi)過量活性氧， 保護(hù)細(xì)胞生物膜和腦細(xì)胞，其活性高低反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力［10-11］。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表 明， 對(duì)氯苯丙氨酸剝奪睡眠 48 h 后， 小鼠腦組織中 SOD活性顯著增高， 說(shuō)明對(duì)氯苯丙氨酸可誘導(dǎo)自由基清除系統(tǒng)出現(xiàn)反應(yīng)性升高。而給以夜關(guān)門提取物后腦組織中 SOD水平有所下降， 且其下降趨勢(shì)與夜關(guān)門給藥劑量成正比，給以高劑量夜關(guān)門提取物時(shí)其SOD水平接近正常大鼠腦組織中 SOD水平， 提示夜關(guān)門能消除氧自由基，減輕對(duì)氯苯丙氨酸所致的小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有較好的腦保護(hù)作用，為夜關(guān)門緩解失眠提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究是基于對(duì)氯苯丙氨酸誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性失眠模型而展開的，屬于短期失眠行為，而失眠是一個(gè)復(fù)雜而特殊的病理現(xiàn)象，因此本研究還存在一定的缺陷。如何找到一個(gè)更切合實(shí)際的動(dòng)物模型，適當(dāng)?shù)剡x擇與失眠相關(guān)的特異性和非特異性指標(biāo)，還有待進(jìn)一步深入研究。

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R285.5

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:1001-1528(2014)02-0383-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.037

2013-09-18

郜紅利 (1967—) ， 男 ( 土家族) ， 副教授， 研究方向: 民族藥物 的開發(fā)與利用。 Tel:(0718)8437810， E-mail:349523825 @qq.com