陳 正， 王伯初*， 祝連彩， 劉紹勇， 薛東升

（1.重慶大學生物工程學院 生物流變學與技術教育部重點實驗室， 重慶 400030；2.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司， 上海 201418）

熊膽粉中熊去氧膽酸結晶條件

陳 正1， 王伯初1*， 祝連彩1， 劉紹勇2， 薛東升2

（1.重慶大學生物工程學院 生物流變學與技術教育部重點實驗室， 重慶 400030；2.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司， 上海 201418）

目的 對熊膽粉中熊去氧膽酸的結晶及重結晶過程加以控制，以提高熊膽粉提取物產(chǎn)率及質量。方法 通過溶解度實驗確定了結晶及重結晶的最佳起始條件，再采用不同的降溫方法對該過程進行梯度控溫的優(yōu)化研究。結果 以70 ℃和 30 ℃做為結晶及重結晶的始末溫度； 篩選出最佳的結晶控溫條件為控溫 8 h， 前 5 h 每 1 h 降溫 2 ℃， 后 3 h每1 h降溫10 ℃， 重結晶工藝控溫條件與結晶控溫條件一致。 應用該結晶工藝， 與原工藝相比， 熊膽粉提取物產(chǎn)率提高 2.38%， 轉化率提高 12.35%， 熊去氧膽酸量提高 5.83%， 鵝去氧膽酸量基本保持不變。 結論 本研究所建立的結晶工藝，可顯著提高熊膽粉中熊去氧膽酸的產(chǎn)率和質量。

熊去氧膽酸；梯度降溫；結晶過程；熊膽粉

熊膽粉屬國家衛(wèi)生部批準的一類新藥［1］， 為粉末、不規(guī)則碎片或顆粒，呈棕黃色，綠黃色或深棕色。具有消炎鎮(zhèn)痛、清熱解毒、平肝明目等功效［2-3］。熊膽 粉 的 主 要 成 分 為 牛 磺 熊 去 氧 膽 酸（TUDCA） 和牛磺鵝去氧膽酸 （ TCDCA）［4］， 經(jīng)水解后可得熊去氧膽酸 （UDCA）、 鵝去氧膽酸 （CDCA）， 現(xiàn)入藥的熊膽粉提取物的主要成分為熊去氧膽酸［5］， 鵝 去 氧 膽 酸 是 熊 去 氧 膽 酸 的 差 向 異構體［6］。

熊膽粉除了含有膽汁酸類成分外，還含有膽固醇、 蛋白質、 色素等非膽汁酸類成分［7］。 由于熊膽粉成分的復雜性，鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的性質又極為相似，使得熊去氧膽酸制備難度較大。目前的工藝主要是通過醇提、水解、酸沉、結晶及重結晶等方法提純熊膽粉提取物，使最終熊膽粉提取物 （以下簡稱精品） 中熊去氧膽酸含有量高于73%， 鵝去氧膽酸含有量低于 15%， 從而達到配方藥的標準。本實驗室通過對目前企業(yè)熊膽粉提取工藝過程的分析和研究發(fā)現(xiàn)，影響熊去氧膽酸量主要原因是結晶過程控制不佳：將經(jīng)過醇提、水解制得的熊膽粉粗提取物用乙酸乙酯提取濃縮后，在30 ℃條件下靜置結晶， 無恒定的初始溫度條件和降溫控制，使工藝結晶條件易受外界環(huán)境氣候的影響。從而導致最終提取的轉化率 （以下轉化率都是指熊去氧膽酸） 低下， 約為 49.54%， 產(chǎn)率低約為 19.96%。 本實驗在此基礎上對熊膽粉結晶及重結晶過程進行控制研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 優(yōu) 普 UPT系 類 超 純 水 器 （ UPT-I-10T， 成都超純科技有限公司）， ACQUITY UPLC型高效液相色譜儀 （ 上海 waters公司），ACQUITY UPLC ELSD型蒸發(fā)光散射檢測器 （上海 waters公司）。

1.2 材料 熊膽粉 （上海凱寶藥業(yè)股份有限公司提供，批號為 s111103）。

1.3 試劑 氫氧化鈉 （重慶市川東化工集團有限公司， 分析純）， 鹽酸 （重慶市川東化工集團有限公司， 分析純）， 乙酸乙酯 （成都市科龍化工試劑廠，分析純），甲醇 （成都市科龍化工試劑廠，分析 純 ）， 甲 醇 （ Merck 公 司， 色 譜 純 ）， 50 mmol/L醋酸銨水溶液 （Merck 公司， 色譜純）， 熊去氧膽酸 （中國食品藥品檢定研究院， 批號110755-9003，20 mg）、鵝去氧膽酸 （中國食品藥品檢定研究院， 批號 110806-200704， 30 mg）

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 溶解度試驗 結晶及重結晶的過程中所涉及到的溶劑均為乙酸乙酯，所以通過測定熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸在乙酸乙酯中的溶解度以確定結晶及重結晶的最佳起始溫度。

采用文獻［8］中的綜合法測定溶解度。 精確稱取一定量的熊去氧膽酸固體粉末，然后向三頸瓶中緩慢加入少量的乙酸乙酯，攪拌，保持溫度在70℃， 粉末未溶解完全， 繼續(xù)攪拌， 如果不溶解再少量多次加入溶劑，直至固體顆粒消失，停止攪拌，靜置，無固體顆粒析出，則緩慢降溫，每次降溫5℃，用同樣的方法測出各個溫度梯度下的溶解度。然后再反向操作，精確移取一定量的乙酸乙酯，向三頸瓶中緩慢加入少量熊去氧膽酸固體粉末， 攪拌， 保持溫度25℃， 溶液澄清， 繼續(xù)多次少量添加熊去氧膽酸，直至固體顆粒出現(xiàn)，繼續(xù)攪拌，不溶，靜置，緩慢升溫，每次升溫5℃，用同樣的方法測出各個溫度梯度下的溶解度。將前一種方法重復2次，3次數(shù)據(jù)結果取平均值可得熊去氧膽酸溶解度結果。用相同的方法測定鵝去氧膽酸的溶解度值。

2.1.2 攪拌試驗 在結晶工藝步驟前添加攪拌過程， 時間為 15 min， 與原工藝重結晶的攪拌時間一致。

2.1.3 結晶及重結晶溫度梯度控制 根據(jù)結晶原理分析，以控溫速率為因素，設置三個梯度的控溫方式，將結晶及重結晶過程的控溫方式設計如下：①控溫 8 h （先按 2 ℃/h 降溫， 控溫 5 h； 再按 10℃/h 降溫， 控溫 3 h）； ②控溫 6 h （先按 5 ℃/h降溫，控溫 4 h； 再按 10 ℃/h 降溫， 控溫 2 h）；③控溫 4 h （按 10 ℃/h 降溫， 4 h）， 詳見表 1。

表1 不同控溫方式試驗的設計Tab.1 Design of different tem Perature con trol tests

2.1.4 熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的測定

2.1.4.1 色譜條件［9］welch ultimate XB-C18色譜柱 （ 4.6 mm×250 mm）； 流動相為甲醇 （A） -50mM醋酸銨水溶液 （B）； 線性梯度洗脫為A相0 ～15 min， 40%→90%； 15.01 min， 90%→40%； 25 min， 40%； 體積 流 量 1.0 mL/min； 柱 溫 40 ℃；ELSD漂移管溫度 45 ℃；霧化氣體積流量 25 Psi；增益500。

2.1.4.2 對 照 品 溶 液 制 備 分 別 精 密 稱 取0.010 5 g熊去氧膽酸、0.010 4 g鵝去氧膽酸對照品于10 mL量瓶中， 用甲醇溶解并定容，分別制成質量濃度為熊去氧膽酸 1.0 mg/mL鵝去氧膽酸 1.0 mg/mL對照品貯備液。

2.1.4.3 供試品溶液制備 分別精密稱取新舊工藝熊膽粉提取物 0.010 2 g和 0.010 1 g供試品于10 mL量瓶中， 用甲醇溶解并定容， 均制成質量濃度為 1.0 mg/mL供試品貯備液。

2.1.4.4 標準曲線的測定 精密量取各對照品貯備液 1.0 mL于 10 mL量瓶中， 再用甲醇稀釋至刻度， 制成質量濃度分別為熊去氧膽酸 0.10 mg/m L，鵝去氧膽酸 0.10 mg/mL的混合對照品溶液。 分別進樣 3 次， 依次為 2、 4、6、 8、10 μL，得圖譜，經(jīng)計算可得回歸方程。

2.1.4.5 樣品的測定 精確量取各供試品貯存液2.0 m L于 10 mL量瓶中， 再用甲醇定容至刻度，制成質量濃度均為 0.2 mg/mL。

進樣量均為8 μL， 得圖譜。

2.2 結果與討論

2.2.1 溶解度試驗 從圖 1 可以看出熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸在乙酸乙酯中的溶解度隨著溫度的增加而線性地增加，其中隨著溫度的升高鵝去氧膽酸線性增加速度更顯著，通過斜率可以得出同一個溫度條件下鵝去氧膽酸溶解度比熊去氧膽酸大 10倍左右。 此實驗結果與文獻［9］所做的實驗結果基本一致。

圖1 熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸在乙酸乙酯中的溶解度Fig.1 UDCA and CDCA in ethyl acetate： the solubility of values

結晶始末溫度的確定 首先設置的起始溫度應低于乙酸乙酯的沸點 77℃； 其次降溫的終止溫度為30 ℃， 一個較大的溫度范圍有利于下一步控溫結晶的實施；最后溫度越高，熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的溶解度差異越大，便于提高熊去氧膽酸量降低鵝去氧膽酸量。 所以選擇 70 ℃作為控溫的起始最佳溫度。為了保證結晶的穩(wěn)定性，將終止溫度設定在 30 ℃ （與原工藝一致）， 整個控溫過程置于水浴中，維持整個體系結晶的平衡穩(wěn)定性，使得工藝不會隨著外界條件的變化而不穩(wěn)定。

2.2.2 攪拌對熊膽粉提取物產(chǎn)率的影響 見表 2。在未將控制初始溫度統(tǒng)一前 （均低于70 ℃），初始溫度易受環(huán)境氣候的影響，使得結晶的范圍不穩(wěn)定，通過初始溫度的添加確定了結晶溫度范圍。

表2 攪拌對熊膽粉提取物產(chǎn)率的影響Tab.2 M ixing of bear bile Powder's influence on the extraction rate of Products

由表2可得出實驗的結果良好，但由于原料所加入的量規(guī)模均較小，所以導致最終提高的產(chǎn)量不是很顯著，但經(jīng)3次重復試驗平均值可得出產(chǎn)率仍提高 0.2%左右。

2.2.3 結晶及重結晶溫度梯度控制 根據(jù)結晶原理分析，以控溫速率為因素，設置3個梯度的控溫方式， 結晶及重結晶過程的控溫方式結果如表3，表4。

經(jīng)過3次重復， 經(jīng) t檢驗后， 可得結晶條件下1、 2、 3 中， 1 與 3 比較有統(tǒng)計學意義， 而 2 與 3比較無統(tǒng)計學意義，但考慮到結晶過程控溫的基本規(guī)律是初始要慢，結晶后期要快。且1的平均值仍然高于 2， 1的控制條件相對精細， 所以選擇 1作為結晶最佳條件。重結晶條件下4與5、 6比較，有統(tǒng)計學意義，所以選擇4作為重結晶的最佳條件。

表3 不同控溫方式試驗的平均產(chǎn)率Tab.3 Productivities of sam Ples in different tem Peratures

表4 不同控溫方式試驗控溫產(chǎn)率 t檢驗Tab.4 Test of sam Ple Productivities in d ifferent tem Peratures

最終可得出在結晶控溫和重結晶控溫均以控溫8 h的條件最佳，得到產(chǎn)率最高，因此選用此結晶及重結晶條件作為最優(yōu)化條件進行試驗。

表5 新舊工藝熊膽粉提取物產(chǎn)率對比Tab.5 Com Parison of bear bile Powader extraction rate between the old Process and the new one

由表5可得出實驗的結果良好，3次原工藝平均產(chǎn)率為 19.96%， 而通過兩次控溫實驗產(chǎn)率最終平均 產(chǎn) 率 可 以 達 到 22.34%， 比 原 工 藝 提 高了 2.38%。

2.2.4 梯度控溫工藝對熊膽粉提取物質量的影響

2.2.4.1 熊去氧膽酸、 鵝去氧膽酸的標準曲線

見表6。

表6 熊去氧膽酸、 鵝去氧膽酸標品回歸方程、 線性范圍及相關系數(shù)Tab.6 Regression equation， linear range and correlation coefficient of UDCA and CDCA reference standards

其中x表示實際進樣量取對數(shù)， y表示為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸各自所對應的峰面積取對數(shù)。通過相關系數(shù)可知，該分析方法的線性關系良好，可用于樣品中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的檢測。

2.2.4.2 梯度控溫結晶工藝對熊膽粉提取物質量的影響 經(jīng)過優(yōu)化后的工藝，熊去氧膽酸量提高5.83%， 熊去氧膽酸轉化率提高 12.35%， 而鵝去氧膽酸的量基本保持不變，符合配方藥標準，說明該結晶過程控溫工藝具有較好的效果。 見表7。

3 討論

3.1 結晶產(chǎn)生的因素主要涉及到在很寬的的溫度和溶液過飽和度范圍內進行，且結晶成核過程與二次成核、 晶 粒 附 聚等 伴 隨 現(xiàn)象 有 關［10-12］。 本 研 究中初始溫度的添加統(tǒng)一了初始結晶標準，使得結晶過程的初始溫度得到控制，不會隨著外界溫度的變化而不穩(wěn)定。

表7 新舊工藝熊膽粉提取物中熊去氧膽酸、 鵝去氧膽酸量及轉化率對比Tab.7 Com Parison of UDCA and CDCA content and conversion contrast between the old Process and the new one

3.2 通過增加攪拌過程， 便于溶質在溶劑中充分溶解，有利于二次成核，避免因濃度過大，初次非均相成核析出過多的物質中含有大量的雜質。結晶的晶核形成模式大體分為初級成核和二次成核。其中初級成核速率過快，使得工藝難以控制，所以在工業(yè)過程應盡量避免。二次成核為大多數(shù)工藝結晶過程的主要來源。二次成核是一個復雜的現(xiàn)象，影響的因素主要包括過飽和度、冷卻速度、攪拌程度等［13］。

3.3 對結晶和重結晶的過程進行控溫控制， 一方面符合二次成核的原理，另一方面也滿足了結晶控溫過程中先慢后快的原則。其原因在于初期晶面小，介穩(wěn)區(qū)窄，易爆發(fā)成核，如果冷卻速度快，會導致晶體在換熱表面生長。結晶后期，由于有大量的晶體存在，晶體有足夠的機會在晶體表面生長，過飽和度比較容易消耗掉。因此后期的降溫速率可以加快［14］。

3.4 通過對結晶及重結晶過程控制， 最終選取了初始溫度為 70 ℃， 攪拌 15 min， 終止溫度 30 ℃，結晶控溫8 h， 重結晶控溫8 h， 最終達到對熊膽粉提取優(yōu)化。使產(chǎn)率提高 2.38%， 熊去氧膽酸轉化率提高 12.35%，熊去氧膽酸量提高 5.83%，鵝去氧膽酸量保持穩(wěn)定，符合配方藥標準對工業(yè)生產(chǎn)具有參考價值。

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Crystallization of ursodeoxycholic acid from bear bile Powder

CHEN Zheng1， WANG Bo-chu1*， ZHU Lian-cai1， LIU Shao-yong2， XUE Dong-sheng2
（1.Key Laboratory of Biorheological Science and Technology， Ministry of Education； College of Bioengineering， Chongqing University， Chongqing 400030， China； 2.Shanghai Kaibao Pharmaceutical Company Limited， Shanghai， 201418， China）

AIM To control the crystallization and recrystallization process in ursodeoxycholic acid extracted from bear bile powder， as well as their improvement in yield and quality.M ETHODS The optimal initial conditions of crystallization and recrystallization were obtained by the solubility experiments.The extraction from bear bile powder processwas improved by differentmethods of gradient temperature controlling.RESULTS The initial and final temperature of crystallization and recrystallization was70 ℃ and 30 ℃ ， respectively.Itwas screened out that the best condition for the crystallization and recrystallization was 8 h.In the first5 hours， the temperature decreased at the rate of2 ℃ per hour.In the following 3 hours， the temperature decreased at the rate of 10 ℃ per hour instead.Comparing with the original process， the extract rate of bear bile powder products increased by 2.38%.The conversion rate increased by 12.35%.The content of ursodeoxycholic acid increased by 5.83%， and chenodeoxycholic acid content kept steady.CONCLUSION The established crystallization process can significantly improve the yield and quality of bear bile powder extract.

ursodeoxycholic acid； temperature gradient； crystallization process； bear bile powder

R284.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0061-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.015

2013-03-12

中央高校基本科研業(yè)務費資助 （CDJXS11230051）

陳 正 （1986—） ， 男， 碩士生， 研究方向： 中藥提取工藝過程。 Tel： 13658314964， E-mail： aijiaying_03@163.com

*通信作 者： 王 伯 初 （ 1962—） ， 男， 教 授， 研 究 方 向： 生 物 制 藥 工 程、 天 然 藥 物。 Tel： （ 023 ） 65112840， E-mail： wangbc2000 @126.com