摘 要：以-4℃模擬低溫脅迫，研究了不同濃度的外源一氧化氮（NO）供體硝普鈉（SNP）在低溫脅迫下對(duì)湖南地區(qū)大面積種植的4個(gè)茶樹品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的動(dòng)態(tài)變化及其相對(duì)下降量的影響。結(jié)果表明，外源NO可不同程度地降低低溫脅迫下四個(gè)茶樹品種葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，且以0.2 mmol/L的SNP處理效果最好，但不同品種以及低溫脅迫處理時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)外源NO的響應(yīng)有差異；0.2 mmol/L SNP處理在低溫脅迫24 h時(shí)對(duì)碧香早和湘妃翠的相對(duì)電導(dǎo)率相對(duì)下降量分別達(dá)7.37%和8.68%，在低溫脅迫48 h時(shí)對(duì)白毫早和湘波綠的相對(duì)電導(dǎo)率相對(duì)下降量分別達(dá)7.23%和5.88%。

關(guān)鍵詞：外源NO；低溫脅迫；相對(duì)電導(dǎo)率；茶樹；湖南

中圖分類號(hào)：Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2014）17-0007-03

Effect of Exogenous Nitric Oxide on Relative Conductivity in Tea Seedlings Leaves under Low Temperature Stress

WANG Ying-zi1，2，HUANG Jian-an1，2，LIU Zhong-hua1，2，LI juan1，3，LI yin-hua1，3，LI shi1，3，TIAN Chang4

（1. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals， Changsha 410128， PRC；2. Ministry of Education’s Key Lab of Tea Science， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC；3.College of Horticulture and Gardening， Hunan Agricultural University，Changsha 410128， PRC；4.College of Resources and Environment， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract：The effects of sodium nitroppmsside（SNP）as an exogenous nitric oxide donor at the -4 ℃ low temperature stress conditions on the dynamic changes of conductivity and relative decline in the amount of content in tea leaves under low temperature stress were studied.The results showed that exogenous NO can reduce the relative conductivity of tea leaves under low temperature stress，and to deal with the effect of SNP concentration in 0.2mmol/L for the best，but there are differences in the effects of different varieties and times ，0.2mmol/LSNP treatment under low temperature stress 24h declines relative conductivity values in Bixiangzao and Xiangfeicui by 7.37% and 8.68%，Baihaozao and Xiangbolv decline in the value of relative conductivity at 48h by 7.23% and 5.88% respectively.

Key words：exogenous nitric oxide； low temperature stress； relative conductance； tea plant； Hunan

收稿日期：2014-08-03

基金項(xiàng)目：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)開放課題基金項(xiàng)目（2013YYX010）

作者簡(jiǎn)介：王英姿（1986-），女，湖南長(zhǎng)沙市人，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種方面的研究。

通訊作者：黃建安，田 昌

茶樹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，喜溫喜濕耐陰但對(duì)低溫較為敏感。低溫是茶樹栽培過程中常見的一種自然災(zāi)害，不僅嚴(yán)重?fù)p害茶樹生長(zhǎng)引起大幅減產(chǎn)，甚至可以導(dǎo)致茶樹死亡[1]，低溫環(huán)境下，細(xì)胞原生質(zhì)流動(dòng)減慢或停止，水分平衡失調(diào)，光合速率減弱，呼吸速率大起大落。因此，研究茶樹的抗寒機(jī)制、篩選優(yōu)良的茶樹抗寒基因、提高茶樹抵御低溫災(zāi)害的能力，已經(jīng)成為茶葉科學(xué)領(lǐng)域重要的研究課題之一[2-3]。

NO作為一種在植物體內(nèi)普遍存在的關(guān)鍵信號(hào)分子，能夠調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，并參與植物體內(nèi)多種非生物脅迫反應(yīng)的信息傳遞[4]。一般認(rèn)為，在黃瓜、枇杷、番茄、香蕉等植物體內(nèi)，NO是通過降低葉片質(zhì)膜透性，提高葉片葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)的含量及相對(duì)含水量，從而抑制過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的積累，增強(qiáng)幼苗體內(nèi)過氧化物酶活性和抗氧化系統(tǒng)活性，進(jìn)而提高植株的抗低溫能力以及冷脅迫后的恢復(fù)能力[5-9]。而研究表明，茶樹中的NO參與了低溫抑制茶樹花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的生理過程[10]，促進(jìn)茶籽萌發(fā)、根部生長(zhǎng)，并可以修復(fù)脫水干燥過程中造成的活性氧傷害，促進(jìn)茶籽萌發(fā)過程中的脂代謝，提高游離氨基酸含量和茶氨酸的積累。但關(guān)于NO提高茶樹抗寒能力的研究目前報(bào)道得還較少。前期的試驗(yàn)結(jié)果表明，0.2 mmol/L硝普鈉（SNP）處理可緩解茶樹低溫脅迫。因此，試驗(yàn)以湖南地區(qū)大面積種植的4個(gè)茶樹品種（碧香早、湘妃翠、湘波綠和白毫早）為材料，在-4℃的低溫脅迫下研究外源噴施不同濃度的SNP（0、0.2和0.5 mmol/L）對(duì)茶樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率及其相對(duì)下降量的影響，旨在初步了解外源NO緩解茶樹低溫脅迫的作用效果，為進(jìn)一步研究外源NO提高茶樹幼苗抗寒的生理機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為碧香早、湘妃翠、湘波綠和白毫早的三年生枝條。主要試劑有外源NO供體硝普鈉

[Na2Fe（CN）5NO·2H2O，簡(jiǎn)稱SNP，生工生物有限公司]，用蒸餾水配成100 mmol/L的母液后4℃保存，用時(shí)按所需濃度（0、0.2和0.5 mmol/L）稀釋。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2014年2～4月進(jìn)行，選取長(zhǎng)勢(shì)一致，無病蟲葉的三年生茶樹枝條水培，常溫培養(yǎng)條件控制溫度20±1℃，光照周期為12 h/d，培養(yǎng)3 d；于第4天向茶樹葉片定量噴施外源SNP。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，分別噴施清水（對(duì)照）、0.2 mmol/L SNP、0.5 mmol/L SNP。噴完后將盆缽移至-4℃的人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫培養(yǎng)，分別于0、8、24、48 h時(shí)采取茶樹枝條芽下第2片成熟片，迅速測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率，每個(gè)處理12次重復(fù)。

1.3 電導(dǎo)率測(cè)定及計(jì)算

細(xì)胞膜透性的測(cè)定采用相對(duì)電導(dǎo)率法[11]：取低溫處理前后各組茶苗完整葉片一份，用打孔器避開主葉脈打孔若干，隨機(jī)取10 片放入干凈的試管中，加入10 mL去離子水，3次重復(fù)。用真空泵抽濾30 min，在25℃下用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率 T1。再將試管放入沸水中10 min，冷卻至25℃，測(cè)定電導(dǎo)率T2。相對(duì)電導(dǎo)率=（T1/ T2）×100%。所有數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)碧香早、湘妃翠、白毫早和湘波綠葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

從圖1和圖2中可以看出，碧香早和湘妃翠兩個(gè)茶樹品種的相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)基本一致，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理葉片的相對(duì)電導(dǎo)率呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。0 h時(shí)，3個(gè)處理葉片的相對(duì)電導(dǎo)率基本一致。低溫處理8 h后，葉片的相對(duì)電導(dǎo)率急劇上升，以0 mmol/LSNP處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率最高，0.2和0.5 mmol/L SNP處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率較低。這說明葉片受到低溫脅迫后，細(xì)胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲，相對(duì)電導(dǎo)率明顯上升，但外源噴施SNP可減緩茶樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率增加的速度。低溫處理24 h后，0 mmol/LSNP處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率在緩慢下降，0.2和0.5 mmol/L SNP處理的下降幅度相對(duì)較大，且0.2 mmol/L SNP處理的相對(duì)電導(dǎo)率最小。這可能是因?yàn)榈蜏孛{迫8 h后茶樹體內(nèi)抗寒基因開始表達(dá)，而外源SNP可提高抗寒基因的表達(dá)水平，降低細(xì)胞膜透性，從而使葉片的相對(duì)電導(dǎo)率下降，且0.2 mmol/LSNP濃度最有利于茶樹抗寒性的增強(qiáng)。低溫處理48 h時(shí)，各處理相對(duì)電導(dǎo)率趨于穩(wěn)定，其大小規(guī)律與處理24 h時(shí)一致，即0.2 mmol/L<0.5 mmol/L<0 mmol/L。

從圖3和圖4中可以看出，白毫早和湘波綠各處理的變化規(guī)律與碧香早和湘妃翠大致相同。白毫早0.2 mmol/L SNP處理在低溫處理8～48 h時(shí)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率整體較低；8 h和48 h時(shí)最低，但8～24 h時(shí)0.5 mmol/L SNP處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率下降速度較快，使其在24 h時(shí)低于0.2 mmol/LSNP處理，而0.2 mmol/LSNP處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率一直在緩慢下降，使48 h時(shí)0.2 mmol/LSNP處理的相對(duì)電導(dǎo)率低于0.5 mmol/LSNP處理。這說明白毫早在不同低溫處理時(shí)間對(duì)外源SNP響應(yīng)程度有差異。湘波綠各個(gè)處理在處理0～24 h內(nèi)相對(duì)電導(dǎo)率一直上升，處理24～48 h才緩慢下降。這可能是因?yàn)橄娌ňG在低溫脅迫后，自身調(diào)節(jié)能力相對(duì)較弱，其抗寒基因表達(dá)的反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，即湘波綠的抗寒性不及其他三個(gè)品種。

2.2 低溫脅迫和SNP處理下茶樹葉片電導(dǎo)率的相對(duì)下降量

從表1中可以看出， 0.2 mmol/LSNP處理4個(gè)品種，在低溫脅迫24 h和48 h時(shí)葉片的電導(dǎo)率相對(duì)下降量基本高于0.5 mmol/LSNP處理，而在8 h時(shí)的變化規(guī)律不明顯。碧香早品種，除低溫處理8 h時(shí)，0.5 mmol/L處理的葉片電導(dǎo)率相對(duì)下降量較大外，其他均以0.2 mmol/L處理的電導(dǎo)率相對(duì)下降量較大，尤其是低溫處理24 h時(shí)，電導(dǎo)率相對(duì)下降量最大，達(dá)7.37%。

湘妃翠品種，電導(dǎo)率相對(duì)下降量的變化規(guī)律與碧香早相同，低溫處理24和48 h時(shí)，0.2 mmol/L SNP處理的葉片電導(dǎo)率相對(duì)下降量分別達(dá)6.68%和6.63%；說明碧香早和湘妃翠在低溫處理24 h時(shí)，0.2 mmol/L SNP對(duì)葉片質(zhì)膜的保護(hù)效果最好。

白毫早品種，也是以0.2 mmol/L SNP處理對(duì)低溫脅迫時(shí)電導(dǎo)率上升的緩解效果較好，其相對(duì)下降量均大于0.5 mmol/L SNP處理；低溫處理48 h時(shí)，電導(dǎo)率相對(duì)下降量最大，為7.23%，而低溫處理24 h時(shí)，相對(duì)下降量較小。

湘波綠品種，電導(dǎo)率相對(duì)下降量的變化規(guī)律與白毫早基本一致，但其相對(duì)下降量較小，低溫處理48 h時(shí)，0.2 mmol/L SNP處理的電導(dǎo)率相對(duì)下降量最大，為5.88%。

綜上所述，說明白毫早和湘波綠在低溫脅迫下0.2 mmol/L SNP處理對(duì)降低葉片相對(duì)電導(dǎo)率的作用效果好于0.5 mmol/L的處理，但對(duì)這兩個(gè)品種的作用效果不及碧香早和湘妃翠明顯，且需至48 h時(shí)葉片電導(dǎo)率相對(duì)下降量才能達(dá)到最高值。

3 討論與結(jié)論

判斷植物抗寒能力大小的指標(biāo)之一是細(xì)胞膜通透性的變化大小。細(xì)胞膜是凍害損傷的關(guān)鍵部位，是阻止胞外結(jié)冰向胞內(nèi)結(jié)冰擴(kuò)展的天然屏障。低溫可使細(xì)胞通透性增加，膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲，從而使細(xì)胞受到損害，甚至死亡。相對(duì)電導(dǎo)率是檢驗(yàn)植物受逆境脅迫后細(xì)胞膜受損傷程度的重要指標(biāo)[12]。

研究表明，每0.5 mmol/L SNP大約可釋放2.0 μmol/L的NO[13]。植物體中，NO的功能具有二元性：低濃度的NO對(duì)植物體具有一定的保護(hù)作用，而高濃度NO則會(huì)嚴(yán)重傷害植物組織和細(xì)胞[14]。前人研究認(rèn)為，外源SNP能降低低溫脅迫下黑麥草幼苗質(zhì)膜相對(duì)透性[15]，隨著SNP濃度的增加低溫脅迫下玉米葉片相對(duì)電導(dǎo)率逐漸下降，且以100 mmol/L的SNP對(duì)低溫脅迫的緩解效果最佳[16]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的SNP處理對(duì)4個(gè)茶樹品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的緩解效果均以0.2 mmol/L的SNP表現(xiàn)最佳，其次為0.5 mmol/L的SNP處理，這與前人研究結(jié)果相似，即適宜濃度的外源SNP可以降低低溫脅迫下茶樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率；但SNP濃度升高，其作用效果減弱。

在低溫處理過程中，4個(gè)茶樹品種葉片的相對(duì)電導(dǎo)率對(duì)外源SNP響應(yīng)效果有差異。低溫脅迫24 h時(shí)，0.2 mmol/L SNP處理對(duì)碧香早和湘妃翠的葉片電導(dǎo)率相對(duì)下降量分別達(dá)7.37%和8.68%；而低溫脅迫48 h時(shí)，0.2 mmol/L SNP處理對(duì)白毫早和湘波綠的葉片電導(dǎo)率相對(duì)下降量分別達(dá)7.23%和5.88%。這可能是由于4個(gè)茶樹品種自身的抗寒性有差異，導(dǎo)致0.2 mmol/LSNP對(duì)不同品種的作用效果不一致，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：成 平）