虞飛 李斌 張晶晶 丁海麥 張學(xué)明

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，包頭 014040）

重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞的研究

虞飛 李斌 張晶晶 丁海麥 張學(xué)明

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，包頭 014040）

為了制備重組人GDNF牛乳腺生物反應(yīng)器，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)雌性牛胎兒成纖維細(xì)胞，連續(xù)繼代培養(yǎng)75 d，進(jìn)行形態(tài)觀察和染色體分析，在此基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染帶有新霉素抗性和紅色熒光蛋白雙重篩選標(biāo)記的重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體pNR-GDNF，G418篩選陽性抗性克隆，進(jìn)行PCR法鑒定。結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細(xì)胞具有正常的形態(tài)、分裂增殖特性和染色體數(shù)目；目的基因已整合到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的染色體上。

牛胎兒成纖維細(xì)胞 分離培養(yǎng) 轉(zhuǎn)基因 GDNF

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器是指通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺大規(guī)模生產(chǎn)供治療人類疾病和保健用的藥用蛋白或其它生物活性物質(zhì)［1］。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺可代替細(xì)菌和細(xì)胞等生物發(fā)酵，對(duì)所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后有效地加工和修飾。因而，動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器被國際上公認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中最具有發(fā)展前景的方向之一，也是實(shí)現(xiàn)基因工程制藥的重要途徑。多年來對(duì)乳腺生物反應(yīng)器的研究已積累了許多方法和經(jīng)驗(yàn)，并在研究中產(chǎn)生了約100種藥物的乳腺生物反應(yīng)器［2］，其中最具有標(biāo)志性的成果是GTC公司用轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人抗凝血酶ATryn?于2006年經(jīng)歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署批準(zhǔn)進(jìn)入治療應(yīng)用［3］。

膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial cell linedireved neurotrophic factor，GDNF）是一種分泌性糖蛋白，屬于TGF-β超家族成員［4］。GDNF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有營養(yǎng)及保護(hù)作用，在帕金森病及其它神經(jīng)損傷疾病的治療方面顯示出了巨大的應(yīng)用前景［4-9］?；趧?dòng)物試驗(yàn)的成功研究，GDNF用于帕金森病的治療已進(jìn)入二期臨床研究［9-13］。然而GDNF在人和動(dòng)物體中含量很低，從動(dòng)物體中制備GDNF用于疾病動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)研究是不現(xiàn)實(shí)的［14］。因而，應(yīng)用生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)重組人GDNF用于疾病動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)研究具有潛在的重大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

本研究采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)了雌性牛胎兒成纖維細(xì)胞，用電擊轉(zhuǎn)染法將以neo基因和DsRed2作為雙篩選因子的牛β-casein基因5'端調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)的重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細(xì)胞，為進(jìn)一步應(yīng)用體細(xì)胞核移植法制備重組人gdnf牛乳腺生物反應(yīng)器的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 活體材料 1-3月齡牛胎兒取自本地屠宰場(chǎng)。1.1.2 質(zhì)粒載體 重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體pNR-GDNF（圖1），本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.3 主要試劑及耗材 DMEM/F12，G418，胰蛋白酶（Trypsin）購自Sigma公司；Taq DNA 聚合酶，限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為TBD產(chǎn)品；無機(jī)鹽類為日本和光試劑；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自QIAGEN；培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿均為Corning公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板為Nunc產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 組織塊法分離和培養(yǎng)牛胎兒成纖維細(xì)胞 采自屠宰場(chǎng)的牛子宮（含胎兒）于37℃滅菌生理鹽水中帶回實(shí)驗(yàn)室，無菌操作挑選雌性胎兒，PBS清洗。參照文獻(xiàn)［15］方法，取胎兒耳部組織于DMEM/F12 + 10% FBS中剪成約1 mm3小塊，用相同培養(yǎng)液洗3遍，然后將組織塊連同培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動(dòng)使組織塊成均勻分布，吸干組織塊周圍的培養(yǎng)液，倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。待組織塊貼壁后，緩緩加入適量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察并記錄細(xì)胞的生長情況。待生長的細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，去除組織塊，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)后，冷凍保存。

1.2.2 牛胎兒成纖維細(xì)胞中期染色體數(shù)目分析 參照文獻(xiàn)［15-17］方法，待細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到70%-80%時(shí)，于4℃冰箱中放置15 h后，加入終濃度為0.1 μg/mL秋水仙素，37℃處理3 h；收集脫壁細(xì)胞，加入37℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl 5 mL，于37℃低滲處理30 min后，再加入1 mL 4℃預(yù)冷的固定液預(yù)固定3 min，低速離心10 min，去上清液；加入固定液6 mL，室溫固定30 min，低速離心10 min，小心吸出大部分上清液，留少量固定液重懸細(xì)胞進(jìn)行滴片；室溫自然干燥后，吉姆薩染色30 min，顯微鏡下觀察拍照，分析核型。

1.2.3 牛胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)G418耐受性的檢測(cè) 將培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于兩個(gè)12孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80%匯合度時(shí)，更換培養(yǎng)液，同時(shí)在12孔板中分別加入G418至終濃度為0、100、200、300、400、500、600、700和800 μg/mL，每種濃度接種2孔細(xì)胞，每2 d換液1次，每天觀察細(xì)胞生長情況，記錄培養(yǎng)在不同G418濃度中的細(xì)胞全部被殺死的時(shí)間。試驗(yàn)重復(fù)2次。以7-10 d內(nèi)殺死全部細(xì)胞的G418的濃度作為篩選時(shí)的最適合濃度。

1.2.4 電穿孔法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×107/mL；取400 μL細(xì)胞懸液加入到間距4 mm電擊杯中，加入12 μg線性化的質(zhì)粒pNRTCNbG使其終濃度為30 μg/mL，輕輕敲擊杯底使DNA和細(xì)胞混勻，550 V電壓、50 μF電容條件下電擊轉(zhuǎn)染，電擊完成后，電擊槽中靜置1 min，冰浴2 min，然后將細(xì)胞以1×106密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，重新以3×105個(gè)細(xì)胞密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，加入G418至終濃度500 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，8-10 d后，在熒光顯微鏡下標(biāo)出紅熒光細(xì)胞克隆；用克隆杯法分離紅熒光克隆細(xì)胞，接種于6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至基本匯合時(shí)，冷凍保存。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定 提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA，PCR檢測(cè)gdnfcDNA是否整合到細(xì)胞基因組DNA中。PCR上游引物：5'-GACCTCGAGATGAA GTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3'，下游引物：5'-GA GCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3'；反應(yīng)條件為：94℃變性45 s，58℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行x2檢驗(yàn)分析，P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 組織塊分離培養(yǎng)牛胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

組織塊貼壁培養(yǎng)3-4 h，加入培養(yǎng)液后僅有極少數(shù)組織塊漂浮，大部分組織塊已貼壁；培養(yǎng)1 d后，部分組織塊邊緣開始游離出少許成纖維細(xì)胞（圖2-A）；培養(yǎng)2 d后，多數(shù)組織塊周圍已有均勻的成纖維細(xì)胞遷出（圖2-B）；培養(yǎng)4 d后，組織塊周圍的成纖維細(xì)胞生長旺盛，數(shù)量明顯增多，向四周擴(kuò)散（圖2-C）；培養(yǎng)6 d后，組織塊周圍的細(xì)胞已生長至完全匯合，且鋪滿了瓶底（圖2-D）；去除組織塊，胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)至T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%匯合時(shí)，冷凍保存，留少量細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)；隨著傳代次數(shù)的增多，絕大部分細(xì)胞呈纖維狀，高度匯合的細(xì)胞呈旋渦狀生長（圖2-E）；說明在細(xì)胞生長過程中，成纖維細(xì)胞呈優(yōu)勢(shì)生長且在細(xì)胞群中占主導(dǎo)地位；傳代培養(yǎng)75 d后，細(xì)胞呈衰老狀態(tài)，生長變得極緩慢，細(xì)胞體積增大，扁平化，有空泡出現(xiàn)等現(xiàn)象（圖2-F）。

2.2 牛胎兒成纖維細(xì)胞的染色體數(shù)目分析

取傳代培養(yǎng)15 d和60 d的牛胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行分裂中期相染色體制片，其中選擇分散良好、輪廓清晰的分裂相進(jìn)行染色體形態(tài)觀察和數(shù)目統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（圖3）表明，絕大多數(shù)細(xì)胞染色體為2n=60，58條常染色體為端部著絲粒，2條性染色體為中部著絲粒。染色體倍型分析結(jié)果表明，培養(yǎng)15 d的牛胎兒成纖維細(xì)胞染色體成二倍性的比例為83.3%，培養(yǎng)60 d的細(xì)胞二倍體比例為77.8%，經(jīng)x2檢驗(yàn)，二者之間無顯著差異（表1）。染色體組型分析表明體外長期培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細(xì)胞能夠進(jìn)行正常的染色體復(fù)制和分裂。

2.3 牛胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)G418的耐受性檢測(cè)

利用不同濃度的G418篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G418的濃度在200-900 μg/mL的范圍時(shí)，對(duì)牛胎兒成纖維細(xì)胞有明顯的毒害作用，細(xì)胞全部被殺死的培養(yǎng)時(shí)間隨G418濃度的增大而縮短。G418濃度為500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)7 d被全部殺死；G418濃度為600 μg/mL時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)6 d被全部殺死（圖4）。因此后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中使用的G418濃度為500 μg/mL。

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選及PCR鑒定

電擊轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì)胞，用G418篩選7 d后，用克隆杯分離形態(tài)正常、生長旺盛的紅熒光抗性克隆，接種到6孔板中生長至基本匯合度時(shí)（圖5），胰蛋白酶消化，冷凍保存。取少量擴(kuò)培細(xì)胞，提取基因組DNA，PCR法檢測(cè)，得到了576 bp預(yù)期條帶（圖6）表明，目的基因已整合到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的染色體上。

3 討論

自1997年體細(xì)胞克隆羊多莉［18］誕生以來，對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾后作為核移植供體細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為乳腺生物反應(yīng)器研制的一種理想策略。用于體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞種類非常廣泛，包括來自胎兒或成體的成纖維細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、睪丸生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等［19］。由此可見，多種分化的體細(xì)胞甚至是分化終端的體細(xì)胞，其細(xì)胞核在卵母細(xì)胞質(zhì)的作用下經(jīng)重編程后仍具有全能性。但由于受到轉(zhuǎn)基因技術(shù)的要求，外源基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后用于核移植的供體細(xì)胞的種類卻很少。對(duì)于轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆動(dòng)物的制備，從細(xì)胞的轉(zhuǎn)染到陽性克隆的獲得再到擴(kuò)大培養(yǎng)至少需要30-40 d，再加上原代細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞純化，到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核移植時(shí)，細(xì)胞在體外培養(yǎng)至少需要50-60 d，遠(yuǎn)比大多數(shù)體細(xì)胞核移植所用的供體細(xì)胞在體外培養(yǎng)的時(shí)間長［15］。胎兒成纖維細(xì)胞具有易分離、易培養(yǎng)、傳代次數(shù)較多、體外培養(yǎng)時(shí)間長、核型較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足篩選時(shí)體外培養(yǎng)時(shí)間長的要求，是目前最理想的可用于遺傳修飾的供體細(xì)胞。已成功的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊［20，21］、山羊［22］、豬［23］、牛［24，25］都是使用基因打靶胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體細(xì)胞而制備的。本研究分離培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細(xì)胞呈典型的纖維狀，生命力旺盛，可連續(xù)傳代培養(yǎng)達(dá)75 d，對(duì)連續(xù)培養(yǎng)60 d的細(xì)胞進(jìn)行初步的核型分析表明細(xì)胞仍具有穩(wěn)定的遺傳特性，可以滿足體外遺傳修飾的要求。

研究者［26，27］認(rèn)為，用混合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆進(jìn)行隨機(jī)整合轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的制備可以避免將研究集中于少數(shù)幾個(gè)發(fā)育潛能未知的單細(xì)胞克隆而導(dǎo)致災(zāi)難性后果，而且短期抗性篩選得到的混合轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞比轉(zhuǎn)染后長期藥物篩選得到的單克隆細(xì)胞更適合于核移植；同時(shí)，這種策略可以增加后代中基因插入位點(diǎn)的可能性，從而有可能篩選出高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系。本研究使用重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體以neo基因和DsRed2作為雙篩選因子，電擊轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì)胞，用G418篩選7 d后，用克隆杯分離形態(tài)正常、生長旺盛的紅熒光抗性克隆，接種到6孔板中生長至基本匯合度時(shí)，冷凍保存，避免了長時(shí)間抗性篩選對(duì)核供體細(xì)胞帶來的不利影響；同時(shí)使用DsRed2作為篩選因子，選用表達(dá)紅熒光蛋白的細(xì)胞作為核供體可排除非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于核移植的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本研究采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)了雌性牛胎兒成纖維細(xì)胞，用重組人gdnf乳腺特異表達(dá)載體pNR-GDNF轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選及PCR鑒定，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組人gdnf的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，為進(jìn)一步應(yīng)用體細(xì)胞核移植法制備重組人GDNF 牛乳腺生物反應(yīng)器的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Transfection of Bovine Fetal Fibroblast with the Vector for Expressing Human GDNF Specifically in Mammary Gland

Yu Fei Li Bin Zhang Jingjing Ding Haimai Zhang Xueming
（Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014040）

In order to prepare bovine mammary gland bioreactor for production of human recombinant GDNF, the female bovine fetal fibroblast cells were successfully isolated using tissue bulk attachment. The fibroblast cells were cultured consecutively for 75 days for further morphologic observation and chromosome analyzing. The plasmid vector pNR-GDNF, which contained the Neorgene and the DsRed2 gene as positive selection marker genes and human GDNF cDNA gene regulated by bovine beta-casein promoter for specific expression in mammary gland, was transfected into the bovine fetal fibroblast cells by electroporation. After selection with G418 for 7 days, resistant cells expressing red fluorescence protein were isolated, cultured, expanded and cryopreserved by standard procedures. The transgenic cells were indentified by PCR. The results showed that bovine fetal fibroblast cells possessed normal morphology, multiplication characteristics and chromosome number and the foreign gene was integrated into the genome.

Bovine fetal fibroblast Isolation and culture Gene transfer GDNF

2014-01-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31060304），內(nèi)蒙古高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJ10184）

虞飛，男，碩士研究生，研究方向：基因工程；E-mail：1012058164@qq.com

張學(xué)明，男，副教授，研究方向：重組藥物蛋白；E-mail：byzhxm@126.com