李俊峰，劉雨瀟，張志文，洪鵬，薛菁暉

1.解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100048；2.遼寧醫(yī)學(xué)院解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，北京 100048

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA binding protein，CIRP）是一種RNA結(jié)合蛋白，又稱hnRNP A18。人CIRP的cDNA序列1997年由Fujita實(shí)驗(yàn)室率先克隆報(bào)道，GenBank/EMBL/DDBJ序列號(hào)為D78135[1]；同年，大鼠CIRP的cDNA由Xue等登錄于 GenBank/EMBL/DDBJ，序 列 號(hào) 為 AB00362[2]。CIRP的相對(duì)分子質(zhì)量為18 000，由172個(gè)氨基酸殘基組成，包括2個(gè)明確的區(qū)域。第一個(gè)為RNA結(jié)合域（RMM基序），其中包括一個(gè)八聚體核糖核蛋白1（RNP1）和一個(gè)六聚體核糖核蛋白2（RNP2），此區(qū)域在不同的種系中高度保守，并且參與結(jié)合RNA；第二個(gè)為富甘氨酸結(jié)構(gòu)（RGG基序），但它的功能還不清楚。

人類的CIRP基因定位在第19號(hào)染色體p13.3位點(diǎn)上[3]。第19號(hào)染色體是人類所有染色體中基因密度最高的，約有1500個(gè)基因，于2004年在Nature雜志上公布了全序列[4]。它具有高G+C含量、高復(fù)制率和高重排率的特點(diǎn)，預(yù)示著該染色體在生物進(jìn)化中有重要意義。其中許多基因與呈孟德爾式遺傳規(guī)律的疾病有關(guān)，包括家族性高膽固醇血癥、非胰島素依賴性糖尿病等。人體遭到輻射或其他環(huán)境污染，控制DNA修復(fù)的基因也在這條染色體上。在K562、HepG2、NC65等多種人類細(xì)胞系及大鼠的腦、肺、腎臟、肝臟、胃、結(jié)腸、卵巢、睪丸、甲狀腺和骨髓組織中[2]，CIRP均有結(jié)構(gòu)性的表達(dá)，并在應(yīng)激原的刺激下表達(dá)升高或降低。

CIRP蛋白的細(xì)胞定位具有組織特異性。在人和動(dòng)物的大多數(shù)細(xì)胞中，CIRP位于細(xì)胞核[1]，然而在人精子細(xì)胞質(zhì)[5]和非洲爪蟾卵母細(xì)胞質(zhì)[6]中也可檢測(cè)到CIRP。有研究者發(fā)現(xiàn)CIRP可在應(yīng)激原的刺激下，由精氨酸甲基化作用支配，從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)中，并據(jù)此推測(cè)CIRP在細(xì)胞中的位置取決于細(xì)胞的類型和狀態(tài)[6]。

作為一種重要的生理活性物質(zhì)，CIRP主要通過轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控來發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控是細(xì)胞生長和分化過程中最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，會(huì)影響多種基因的蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的特定位置，從而影響細(xì)胞的分化方向。RNA結(jié)合蛋白是轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)調(diào)控的主要承擔(dān)者，調(diào)節(jié)mRNA的剪輯、出核、運(yùn)輸和細(xì)胞定位等[7]，并由此改變細(xì)胞的生理功能。目前對(duì)CIRP的研究主要在低溫（32℃）下，其調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)在于mRNA的翻譯，通過CS-RBD來特異地與靶RNA的特異結(jié)構(gòu)或序列結(jié)合來調(diào)控特定基因表達(dá)，從而對(duì)環(huán)境信號(hào)做出快速反應(yīng)。另外，CIRP結(jié)合到mRNA的5′或3′非翻譯區(qū)（UTR）可以影響翻譯起始的速度和轉(zhuǎn)錄子的穩(wěn)定性。但有一些問題還待進(jìn)一步研究：一個(gè)RNA結(jié)合蛋白有多少個(gè)目標(biāo)mRNA；RNA結(jié)合蛋白與mRNA的5′或3′UTR結(jié)合是否依賴其他蛋白，以及這些蛋白是如何影響其功能的；上述相互作用是如何增強(qiáng)或阻礙翻譯的。

1 CIRP與應(yīng)激反應(yīng)

應(yīng)激是指機(jī)體在受到應(yīng)激原剌激時(shí)所出現(xiàn)的以交感神經(jīng)興奮和垂體-腎上腺皮質(zhì)分泌增多為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，以及由此而引起的各種機(jī)能和代謝的改變。應(yīng)激是一種全身性的適應(yīng)性反應(yīng)，在生理學(xué)和病理學(xué)中都有非常重要的意義，適當(dāng)?shù)膽?yīng)激對(duì)機(jī)體可以產(chǎn)生保護(hù)作用，過度應(yīng)激則會(huì)造成傷害。應(yīng)激是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程，通過研究它的發(fā)生原理、進(jìn)程及其調(diào)控，使生物體能夠在有效進(jìn)行生理性應(yīng)激的同時(shí)，最大限度地降低病理性應(yīng)激及其帶來的損害，無疑對(duì)人們?nèi)粘Ｉ罴芭R床患者治療都具有指導(dǎo)意義。此前多項(xiàng)研究表明，CIRP的表達(dá)水平受到眾多環(huán)境因素的影響，在低溫[8]、紫外線[9]、高滲[10]、缺氧[11]等應(yīng)激狀態(tài)下，CIRP 發(fā)揮著重要的細(xì)胞保護(hù)作用。

首先，CIRP的表達(dá)與低溫高度相關(guān)，37℃條件下CIRP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不包含CIRP全長開放讀框，溫和冷處理可顯著提高CIRP的表達(dá)水平，相反熱處理會(huì)降低其表達(dá)水平。有研究者將K562、HepG2、NC65等細(xì)胞系由37℃轉(zhuǎn)移至29℃，發(fā)現(xiàn)CIRP基因的表達(dá)水平在前12 h內(nèi)顯著升高，并據(jù)此推測(cè)CIRP在冷應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。2006年，Sakurai等[8]發(fā)現(xiàn)低溫條件下CIRP能夠抑制腫瘤壞死因子TNF-γ和環(huán)已酞亞胺介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。2007年Kim等[12]研究表明，來源于擬南芥的CIRP蛋白能顯著提高大腸桿菌對(duì)低溫的適應(yīng)能力。2011年本研究小組發(fā)現(xiàn)，低溫條件下CIRP可抑制H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[13]。

除了低溫外，缺氧也是影響CIRP表達(dá)水平的重要因素。氧濃度對(duì)于血管神經(jīng)發(fā)育、糖代謝等生理活動(dòng)有著重要的調(diào)節(jié)作用，當(dāng)氧濃度降低時(shí)低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）被活化，HIF-1可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascu?lar endothelial growth factor，VEGF）和葡萄糖載體1（glucose transporter，Glut1）等蛋白的轉(zhuǎn)錄水平來促進(jìn)血管生成，緩解低氧對(duì)生物體造成的損傷。最新的研究發(fā)現(xiàn)：①低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與低溫信號(hào)通路具有相同的組成元素。受低氧調(diào)控的mRNA與受低溫調(diào)控的mRNA都包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，大部分mRNA的翻譯水平會(huì)受到影響，然而含有IRES元件的mRNA仍可有效翻譯。②CIRP的mRNA序列中存在HIF-1α共有序列結(jié)合位點(diǎn)，低氧環(huán)境可通過HIF-1不依賴的機(jī)制誘導(dǎo)CIRP的表達(dá)[14]。

此外，大量的體外實(shí)驗(yàn)證明CIRP在紫外線照射及高滲透壓條件下，發(fā)揮著細(xì)胞保護(hù)作用。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線照射損傷后，CIRP會(huì)由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中，并通過綁定特定的轉(zhuǎn)錄因子來活化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，使細(xì)胞迅速對(duì)環(huán)境信號(hào)做出應(yīng)答[15]。具體過程如下：第一步，CIRP蛋白在應(yīng)激信號(hào)的誘導(dǎo)下發(fā)生轉(zhuǎn)位，聚集于細(xì)胞質(zhì)的應(yīng)激顆粒中，并發(fā)生甲基化。C端的甲基化水平?jīng)Q定了CIRP在細(xì)胞中的定位情況，而CIRP的定位情況似乎最終決定了應(yīng)激狀態(tài)下某種mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是發(fā)生降解還是發(fā)生易位。第二步，應(yīng)激顆粒中的CIRP蛋白募集特異的mRNA，使它們移入應(yīng)激顆粒。在紫外線照射下，靶向mRNA的3′UTR會(huì)直接與CIRP發(fā)生相互作用。最后一步，CIRP蛋白綁定復(fù)制蛋白A及硫氧還蛋白的3′UTR，通過與翻譯元件的相互作用來從翻譯水平調(diào)節(jié)特定mRNA的表達(dá)量。硫氧還蛋白是一種廣泛存在的多功能蛋白，可通過抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）來調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可將H2O2還原為H2O，還可活化HIF-1與VEGF。

紫外線照射、低氧等應(yīng)激因素除了通過甲基化修飾來調(diào)節(jié)CIRP的表達(dá)，還可通過活化GSK3β激酶使CIRP發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中綁定硫氧還蛋白基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此，深入研究體內(nèi)促使CIRP發(fā)生磷酸化的激酶，從而闡明在不同應(yīng)激條件下CIRP發(fā)揮作用的機(jī)制是下一步研究的熱點(diǎn)。

2 CIRP與腫瘤發(fā)生

腫瘤發(fā)生的過程可以分為細(xì)胞永生化、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞侵潤、細(xì)胞轉(zhuǎn)移幾個(gè)階段。細(xì)胞過度生長是腫瘤發(fā)生的重要因素，然而有機(jī)體具有精密的機(jī)制用以防止細(xì)胞不受控制的生長和惡變，細(xì)胞衰老就是其中之一。因此，當(dāng)細(xì)胞因?yàn)榛蛲蛔兌苊馑ダ蠒r(shí)，腫瘤就會(huì)發(fā)生。1997年，Nishiyama等[1]發(fā)現(xiàn)CIRP在低溫環(huán)境中可調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的周期；2006年，Sakurai等[3]發(fā)現(xiàn)低溫條件下CIRP具有抗凋亡作用；2009年，Artero等[16]發(fā)現(xiàn)低溫等外界刺激引發(fā)的CIRP升高會(huì)增加P-ERK1/2的表達(dá)水平，并影響翻譯起始蛋白4EB-P1與S6的磷酸化水平，從而使小鼠胚胎細(xì)胞發(fā)生永生化。上述研究提示，在溫和低溫條件下，內(nèi)源性CIRP的活化可以極大限度地抑制細(xì)胞凋亡。此后的大量研究表明，生理?xiàng)l件下CIRP與腫瘤的發(fā)生具有密切聯(lián)系。有研究分析了193例相同年齡段腫瘤患者的CIRP表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CIRP表達(dá)升高與腫瘤發(fā)生具有相關(guān)性，33%結(jié)腸癌患者與45%乳腺癌患者的CIRP表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。2009年Zeng等[17]發(fā)現(xiàn)抑制CIRP蛋白的活性會(huì)降低前列腺癌細(xì)胞（LNCaP，PC-3）的增殖能力，敲除CIRP基因不僅能降低癌細(xì)胞存活率，還能提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。此外有研究證實(shí)，HeLa、TERA2等細(xì)胞的生長也會(huì)因CIRP表達(dá)的降低而受到抑制。這提示CIRP也可被作為治療癌癥的靶點(diǎn)。

目前，對(duì)CIRP促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制的看法是：翻譯水平的突變?cè)诩?xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生中起重要作用，在常溫條件下，CIRP可通過與翻譯元件的相互作用來促進(jìn)mRNA的翻譯，加快特定蛋白的合成、刺激細(xì)胞增殖。其詳細(xì)作用機(jī)制尚不明確。

3 CIRP在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用

1998年，Nishiyama等[18]發(fā)現(xiàn)CIRP位于小鼠神經(jīng)元細(xì)胞核中，氨基酸序列類似于植物晝夜節(jié)律蛋白，可在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域晝夜節(jié)律性表達(dá)，白天表達(dá)水平升高，夜間表達(dá)水平下降，并據(jù)此認(rèn)為CIRP對(duì)神經(jīng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。2008年Stephanie等發(fā)現(xiàn)XCIRP在非洲蟾蜍的前腦發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用，敲除XCIRP會(huì)使蟾蜍前腦神經(jīng)板異常增大。2010年，Saitoa等[19]將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)于含或不含表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)去除EGF會(huì)增加神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率、降低巢蛋白（nestin）陽性細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。然而適當(dāng)?shù)牡蜏貤l件可通過活化CIRP來抑制去除EGF所引發(fā)的干細(xì)胞凋亡與分化，維持神經(jīng)干細(xì)胞的干性。該研究提示CIRP在低溫神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮著重要作用，有望用于神經(jīng)干細(xì)胞的冷凍保存。

本研究小組1997年從大鼠睪丸中克隆出CIRP基因，多年來一直致力于對(duì)CIRP基因的研究[2,20-21]。近年，我們主要探討了CIRP在神經(jīng)保護(hù)方面的作用，發(fā)現(xiàn)在常溫環(huán)境下，CIRP在腦皮層和海馬中低水平表達(dá)，在下丘區(qū)僅有微量表達(dá)；在低溫環(huán)境下，腦組織中CIRP表達(dá)水平明顯升高，且具有區(qū)域性和時(shí)間性差異，下丘腦區(qū)的CIRP表達(dá)增強(qiáng)的出現(xiàn)明顯早于其他腦區(qū)。此外，缺血性損傷可以推遲低溫造成的CIRP的表達(dá)，但并不能降低CIRP的表達(dá)量。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析了CIRP在低溫條件下對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境能通過活化CIRP來抑制H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果提示，CIRP在低溫神經(jīng)保護(hù)中可能發(fā)揮重要作用。

4 CIRP調(diào)節(jié)生物節(jié)律相關(guān)基因的表達(dá)

2012年，有關(guān)CIRP的生物學(xué)功能研究有了突破性進(jìn)展。日內(nèi)瓦大學(xué)的Schibler教授揭示了體溫節(jié)律性變動(dòng)影響“晝夜節(jié)律基因”表達(dá)的分子機(jī)制[22]。他們發(fā)現(xiàn)溫度的變化可調(diào)節(jié)CIRP蛋白的節(jié)律性表達(dá)，是體內(nèi)晝夜節(jié)律基因激活的必要條件。我們身體中的大部分細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)“晝夜節(jié)律調(diào)解系統(tǒng)”,由一組基因組成，周期性變化。研究人員還發(fā)現(xiàn)，與大部分調(diào)控蛋白不同，CIRP是通過結(jié)合到某些基因轉(zhuǎn)錄物的RNA上來控制這些基因的表達(dá)并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的。機(jī)體的許多生理功能如心率、激素分泌、體溫等都與細(xì)胞內(nèi)部晝夜節(jié)律基因表達(dá)的時(shí)相及強(qiáng)弱相關(guān)，CIRP與這些調(diào)控的關(guān)系正一一解明。同一團(tuán)隊(duì)利用開發(fā)的尖端遺傳工程技術(shù)鑒別了活細(xì)胞中幾乎所有與CIRP結(jié)合的靶RNA，得出“在細(xì)胞中CIRP結(jié)合了編碼不同晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)器蛋白的轉(zhuǎn)錄物，提高了它們的穩(wěn)定性，使得它們累積”的結(jié)論，說明這種調(diào)節(jié)順序是，溫度變化誘導(dǎo)CIRP表達(dá)發(fā)生變化，再激活下游晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)器基因，引發(fā)機(jī)體發(fā)生生物學(xué)功能改變。這一發(fā)現(xiàn)，使我們觀察到的每1℃體溫差異都呈現(xiàn)出新的意義。受到CIRP調(diào)控的這些生化體系中，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)參與藥物解毒和代謝的蛋白DBP（albumin D-site-binding protein），它的周期性累積可對(duì)藥物代謝起調(diào)節(jié)作用。有些抗癌藥物在早上給予患病的小鼠可導(dǎo)致100%的死亡率，而在晚上接受同樣劑量的小鼠卻全部存活了下來。這表明體內(nèi)生物鐘對(duì)藥物的效用和毒性有著極其重要的影響。

5 CIRP的其他作用

CIRP除了調(diào)控與晝夜節(jié)律相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)度外，可能也參與其他細(xì)胞過程，如細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞黏著相關(guān)功能。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肝細(xì)胞再生依賴這一調(diào)節(jié)過程[23]。還有研究表明，CIRP在胚胎發(fā)育、動(dòng)物冬眠等活動(dòng)中也起重要作用。Saito等[24]發(fā)現(xiàn)牛蛙腦中CIRP的表達(dá)量受到季節(jié)的影響，夏季表達(dá)降低，冬季則顯著升高，并據(jù)此推測(cè)CIRP表達(dá)變化與動(dòng)物冬眠相關(guān)，可能在冬眠過程中發(fā)揮一定的作用。2008年Kenkichi等[25]以日本樹蛙為模型再次證實(shí)CIRP的表達(dá)量與動(dòng)物冬眠之間存在著一定的關(guān)系。盡管觀察到了上述現(xiàn)象，CIRP在動(dòng)物冬眠中所發(fā)揮的具體作用還有待進(jìn)一步研究。在原腸（胚）形成過程中CIRP高表達(dá)，有研究者降低了非洲爪蟾胚胎中CIRP的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)超過半數(shù)的胚胎在22細(xì)胞期時(shí)死亡，此外該研究者還發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育至32細(xì)胞期時(shí)降低CIRP的表達(dá)量會(huì)導(dǎo)致胎腎發(fā)育異常。

6 結(jié)語

綜上所述，CIRP作為一種冷應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，廣泛參與細(xì)胞的各種生理過程，并在其中發(fā)揮重要作用。有關(guān)CIRP的研究將有助于揭示應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制，其在神經(jīng)元缺氧狀態(tài)下抗凋亡作用的發(fā)現(xiàn)，也為神經(jīng)保護(hù)藥物開發(fā)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。鑒于其表達(dá)改變會(huì)對(duì)細(xì)胞生長周期帶來影響的特點(diǎn)，我們也思考其抑制腫瘤細(xì)胞生長的可能性。有關(guān)CIRP的研究已取得了可喜進(jìn)展，今后還有很多領(lǐng)域吸引我們的關(guān)注，如與CIRP發(fā)生結(jié)合的眾多mRNA，其編碼的蛋白質(zhì)在體內(nèi)具有何種功能，是如何被調(diào)節(jié)的；CIRP與靶mRNA的結(jié)合是否依賴上游蛋白的調(diào)節(jié)；CIRP在神經(jīng)元保護(hù)功能中的作用機(jī)制等。溫和的低溫條件是誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白的有效工具。在32～33℃條件下，CHO細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白的效率遠(yuǎn)高于37℃。已知低溫保護(hù)可用于包括心臟外科、神經(jīng)外科、器官移植中的器官轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)領(lǐng)域，低溫對(duì)心臟停搏或中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血的治療及預(yù)后具有重要意義。還有文獻(xiàn)報(bào)道，哺乳動(dòng)物對(duì)溫和低溫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)與長時(shí)間航天旅行相似。我們認(rèn)為，由溫度改變引發(fā)的CIRP表達(dá)量的改變，進(jìn)而造成下游一系列的生物學(xué)改變，其對(duì)生命過程的意義值得深入研究。

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