孟娟麗，沈曉玲，譚文杰

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

冠狀病毒（coronavirus，CoV）是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒，宿主范圍廣泛，人和多種動物普遍易感，與人和動物的許多疾病有關(guān)。有4種普遍流行的人冠狀病毒[1]，包括HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，主要引起普通感冒癥狀。除此之外，2003年暴發(fā)的SARS-CoV和2012年9月新鑒定的MERS-CoV均屬于高致病性人冠狀病毒[2-3]，常導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸窘迫綜合征，有較高的病死率。2003年自中國暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）波及30多個國家，導(dǎo)致約8000人感染，其中700余人死亡，病死率約10%。2005年以來未見新的感染病例報道，但多種研究證據(jù)表明SARS-CoV來源于動物，再次發(fā)生跨種屬傳播的可能性依然存在。

目前尚無治療SARS-CoV感染的特效抗病毒藥物，故研制安全有效的SARS疫苗，開展人群特別是高危人群免疫接種是較好的防控措施之一。目前已報道的SARS-CoV疫苗包括滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗和病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）疫苗[4]。其中VLP疫苗是由某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白組成的不含病毒基因組的空心顆粒，因此不能自主復(fù)制，不具有感染性。VLP疫苗較滅活疫苗或減毒活疫苗更安全，同時較亞單位疫苗或DNA疫苗的免疫原性強(qiáng)，因此，SARS-CoV VLP很有潛力成為候選應(yīng)用疫苗。我們對SARS-CoV VLP疫苗的組成、制備與應(yīng)用簡要綜述如下。

1 SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白及VLP疫苗的組成與免疫特性

SARS-CoV基因組全長約27 kb，由14個開放讀框組成。其中5個開放讀框是所有已知的冠狀病毒都具有的，分別編碼復(fù)制酶1a/1b、S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白；其余的8個開放讀框編碼大小為39～274個氨基酸殘基的輔助蛋白（3a、3b、6、7a、7b、8a、8b、9b），是SARS-CoV所特有的，與其他冠狀病毒輔助蛋白的氨基酸序列幾乎無同源性[4]。S蛋白、3a蛋白、M蛋白和E蛋白是SARS-CoV的包膜蛋白，位于病毒表面，理論上都能產(chǎn)生中和性抗體保護(hù)機(jī)體。研究表明，S蛋白和3a蛋白在體外均能誘導(dǎo)中和性抗體[5]；S蛋白和N蛋白共同引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但被動轉(zhuǎn)移研究表明S蛋白是保護(hù)性免疫的主要抗原，僅S特異性抗體能阻止SARS-CoV在小鼠模型中復(fù)制[6]。

S蛋白是SARS-CoV最大的結(jié)構(gòu)蛋白，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是冠狀病毒感染細(xì)胞的重要蛋白，決定其感染的種屬特異性和組織嗜性。同時，S蛋白也是產(chǎn)生中和性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要靶抗原[5]。S蛋白S1區(qū)的受體結(jié)合區(qū)（RBD）包含多種構(gòu)象中和表位，與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）受體結(jié)合，介導(dǎo)SARS-CoV進(jìn)入宿主細(xì)胞。S蛋白是高度糖基化蛋白，主要抗原表位的抗原性依賴于蛋白構(gòu)象和糖基化，故S蛋白適合在真核系統(tǒng)中表達(dá)。

M蛋白是SARS-CoV最大的跨膜蛋白，包含3個跨膜區(qū)，大部分位于包膜內(nèi)與N蛋白結(jié)合，僅N端N-糖基化小部分位于包膜外。M蛋白的3個跨膜區(qū)都參與M蛋白的自我組裝與亞細(xì)胞定位，其中第一個跨膜區(qū)最重要[7]，缺失突變M蛋白的跨膜區(qū)影響M蛋白的亞細(xì)胞定位[8]。糖基化方式不影響M蛋白的定位、自我組裝及釋放。

E蛋白屬于Ⅱ型跨膜蛋白，至少包含1個跨膜區(qū)，相對分子質(zhì)量約為10 000，僅在病毒包膜及感染細(xì)胞表面少量表達(dá)。不論在體內(nèi)或體外，E蛋白不是SARS-CoV復(fù)制所必需的，但缺乏E蛋白導(dǎo)致其毒力減弱。E蛋白不僅能改變宿主細(xì)胞膜的滲透性[9]，而且能作用于PALS1（參與上皮細(xì)胞緊密連接的一種蛋白質(zhì)），破壞肺上皮細(xì)胞的緊密連接[10]。

N蛋白的氨基酸序列相對保守，與RNA結(jié)合形成核衣殼，相對分子質(zhì)量為50 000～60 000，位于包膜內(nèi)，其特異性抗體在體外不能中和SARS-CoV。SARS-CoV N蛋白組裝入病毒樣顆粒的主要功能區(qū)位于N蛋白168～421氨基酸殘基[11]。N蛋白常被用于血清學(xué)診斷。

3a蛋白由開放讀框3編碼，包含274個氨基酸殘基，位于S與E蛋白之間，相對分子質(zhì)量約31 000，是SARS-CoV最大的輔助蛋白。3a蛋白是包含3個跨膜區(qū)的O型糖基化蛋白，不僅能活化NF-κB、上調(diào)上皮細(xì)胞纖維蛋白原表達(dá)促進(jìn)SARS-CoV的感染，也能促進(jìn)破骨細(xì)胞生成[12]。盡管3a蛋白能插入VLP，但3a蛋白不是SARS-CoV組裝所必需的。恢復(fù)期病人的血清中能檢測到3a特異性抗體。

多項研究表明，SARS-CoV的M蛋白與E蛋白或N蛋白同時表達(dá)能組裝成VLP，M蛋白對病毒顆粒的組裝至關(guān)重要。此外，S蛋白的2個軟脂酰化半胱氨酸（C1234/1235）是S蛋白組裝入VLP必不可少的，但不參與M-S共定位，M-S共定位和S蛋白組裝入VLP彼此是相互獨(dú)立的[13]。最近，Tseng等發(fā)現(xiàn)SARS-CoV M蛋白具有自我組裝并以包膜小泡形式釋放到胞外的能力，和N蛋白同時表達(dá)能組裝成VLP[8，14]。體外實(shí)驗(yàn)也表明，SARS-CoV M 蛋白的保守區(qū)是介導(dǎo)M-M相互作用的基礎(chǔ)，N蛋白與M蛋白相互作用促進(jìn)包膜蛋白復(fù)合物的組裝[7]。

2 SARS-CoV病毒樣顆粒的制備方法

對病毒感染性疾病而言，VLP是一種理想的疫苗形式。形態(tài)上，VLP類似未成熟的病毒粒子；功能上，具有天然病毒的類似嗜性，通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，激發(fā)強(qiáng)有力的特異性體液和細(xì)胞免疫[15]。目前獲準(zhǔn)用于人類的VLP疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗和戊型肝炎病毒疫苗，已在人群中廣泛應(yīng)用并取得良好效果。同時，許多病毒的VLP也被用于基礎(chǔ)性研究，如病毒的組裝機(jī)制及結(jié)構(gòu)研究、病毒與宿主或蛋白與蛋白之間的相互作用[8，13-14]。

多種表達(dá)系統(tǒng)可用于制備病毒樣顆粒，包括原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（B/IC）、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物。其中B/IC和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)均能進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾并易于快速生產(chǎn)，是應(yīng)用最為廣泛的VLP制備技術(shù)平臺。

2.1 桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是以桿狀病毒為外源基因載體、昆蟲細(xì)胞或活體昆蟲為受體的真核表達(dá)系統(tǒng)。桿狀病毒能容納大片段的外源基因，關(guān)閉宿主細(xì)胞早期基因轉(zhuǎn)錄而高水平表達(dá)目的蛋白，并能進(jìn)行簡單的翻譯后修飾。重組桿狀病毒制備簡單、快速，能在10～12周內(nèi)完成新病毒VLP疫苗的生產(chǎn)，特別是一些表面蛋白易于突變的病毒如流感病毒、冠狀病毒等。B/IC系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是同時表達(dá)大量難以與VLP分離的桿狀病毒粒子，其具有佐劑活性，如果不去除或滅活，能顯著增加VLP的免疫原性[16]。除此之外，超速離心是純化VLP的主要方法，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

用B/IC系統(tǒng)制備SARS-CoV VLP須同時表達(dá)M蛋白和E蛋白[17]，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)能組裝成穩(wěn)定光滑類似于SARS-CoV粒子的球形VLP；若同時表達(dá)S蛋白，則能高效組裝和釋放分泌型VLP[18]；同時表達(dá)3a蛋白、M蛋白和E蛋白，3a蛋白也組裝進(jìn)VLP[17]。Liu等利用B/IC系統(tǒng)同時表達(dá)SARS-CoV的S蛋白和流感病毒M1基質(zhì)蛋白，組裝成了高產(chǎn)量的嵌合型S/M1 VLP，免疫小鼠后可誘導(dǎo)SARS-CoV S蛋白特異的免疫應(yīng)答及中和抗體，并獲得有效保護(hù)[19]。Bai等同時表達(dá)SARS-CoV的M、E蛋白和SARS樣CoV（SARS-like CoV，SL-CoV）的S蛋白，也成功獲得嵌合型VLP，S蛋白插入了VLP表面[20]。因此，應(yīng)用B/IC系統(tǒng)制備SARS-CoV VLP，必須至少同時表達(dá)M蛋白和E蛋白。

2.2 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是以質(zhì)粒作為外源基因載體、哺乳動物細(xì)胞為宿主的真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，進(jìn)行復(fù)雜的糖基化、磷酸化和乙?；榷喾N翻譯后加工功能，表達(dá)的產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面都最接近于天然高等生物蛋白質(zhì)，并且在蛋白合成起始信號、加工、分泌等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)類似于BI/C，能表達(dá)單個結(jié)構(gòu)蛋白或多個結(jié)構(gòu)蛋白的VLP（多達(dá)5個結(jié)構(gòu)蛋白），表達(dá)水平大多都能達(dá)1 mg/L。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的主要不足之處是復(fù)雜的上、下游處理所需的高生產(chǎn)成本、表達(dá)產(chǎn)量低和可控性低。

應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)SARS-CoV VLP的研究表明，M蛋白和N蛋白是形成SARSCoV VLP的必需結(jié)構(gòu)蛋白[8，14]，缺乏M蛋白和（或）N蛋白均不能形成VLP[21-22]。除此之外，Hsieh等發(fā)現(xiàn)M蛋白和E蛋白必須同時表達(dá)才能形成SARS-CoV VLP[23]；Xu等進(jìn)一步證實(shí)9b蛋白必須和M蛋白、E蛋白同時表達(dá)才能組裝入VLP，而不是依賴于N蛋白或S蛋白的表達(dá)[24]。但是，Siu等表明，M蛋白、E蛋白必須和N蛋白同時表達(dá)才能有效地組裝和釋放SARS-CoV VLP[25]。Lokugamage等分別同時表達(dá)SARS-CoV、小鼠肝炎病毒（MHV）的4個結(jié)構(gòu)蛋白，均能組裝成VLP，且MHV VLP的產(chǎn)量較SARSCoV VLP高17倍。同時，Lokugamage等將SARSCoV的S蛋白與MHV的M蛋白、N蛋白、E蛋白同時表達(dá)，其嵌合VLP產(chǎn)量較SARS-CoV VLP高8倍。Lokugamage等通過用不同的轉(zhuǎn)染試劑和用不同濃度的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞系，表明293T細(xì)胞來源的嵌合VLP產(chǎn)量較Vero細(xì)胞高10倍[15]。

3 SARS-CoV VLP疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特點(diǎn)與安全性

多項研究表明，SARS-CoV VLP免疫小鼠后能引起強(qiáng)有力的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[18-19,26]。SARS-CoV VLP可活化未成熟樹突狀細(xì)胞高表達(dá)共刺激分子CD40、CD86、CD80和成熟標(biāo)記分子CD83，分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-4、TNF-α和TNF-γ，從而激活初始T細(xì)胞[20]。由于TNF-γ明顯高于IL-4，樹突狀細(xì)胞主要誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞。皮下注射VLP的小鼠也能檢測到IL-4和TNF-γ增高，且 TNF-γ比 IL-4高 9倍[18]。SARSCoV VLP經(jīng)腹腔注射或滴鼻免疫都能誘導(dǎo)血清特異性IgG升高，滴鼻組血清滴度相對較低，但局部黏膜sIgA的升高很明顯[26]。VLP肌注或滴鼻，在有或無佐劑的情況下都能完全保護(hù)攻毒的小鼠，抑制肺內(nèi)病毒復(fù)制[15,19]。

Tseng等報道，SARS-CoV VLP免疫小鼠產(chǎn)生中和性抗體的同時，也導(dǎo)致肺組織產(chǎn)生了Th2型免疫病理損害[27]，類似于兒童接種滅活呼吸道合胞病毒疫苗后引起的免疫病理反應(yīng)，他們認(rèn)為N蛋白可能是引起肺組織免疫病理的主要抗原。因此，SARSCoV VLP抗原選擇與應(yīng)用的安全性問題仍待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

4 結(jié)語

近30年來，VLP大規(guī)模制備與純化技術(shù)已得到快速發(fā)展，迄今已有110余個VLP被制備及應(yīng)用評估。與SARS-CoV亞單位蛋白或多肽相比，VLP類似于天然病毒，能提呈多種構(gòu)象表位，誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。更重要的是，對于高致病性的SARS-CoV，VLP不含SARS-CoV的基因組，無感染性，無須滅活或減毒，無生物安全隱患。盡管SARSCoV VLP疫苗具有很好的應(yīng)用前景，但目前尚無SARS-CoV VLP疫苗產(chǎn)品獲準(zhǔn)在人群中應(yīng)用評價，其抗原選擇及制備工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，VLP疫苗的應(yīng)用策略與保護(hù)效果仍有待在大動物感染模型及人群中驗(yàn)證與改進(jìn)。

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