李 超，李鑫鋼，2，隋 紅，2*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.精餾技術(shù)國家工程研究中心，天津 300072）

隨著社會(huì)的發(fā)展和科技的進(jìn)步，化石燃料的大量使用造成的環(huán)境污染和能源危機(jī)問題日益嚴(yán)重，世界各國均著力開發(fā)清潔的可再生能源。氫能因其能量密度高、清潔無污染和熱轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最理想的礦石燃料替代能源[1]。生物制氫是一種新型的制氫方法，是把自然界中水或有機(jī)物中的能量通過產(chǎn)氫菌的作用轉(zhuǎn)化為氫氣，是微生物自身新陳代謝的作用，反應(yīng)在常溫常壓的溫和條件下進(jìn)行，同時(shí)可以將各種工農(nóng)廢棄物、廢水作為反應(yīng)原料，實(shí)現(xiàn)廢物利用和能源生產(chǎn)的雙重作用。與傳統(tǒng)的制氫方法相比，生物發(fā)酵制氫以其環(huán)境友好和產(chǎn)氫穩(wěn)定性高等優(yōu)勢成為一種新興的氫氣生產(chǎn)技術(shù)[2]。厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫可利用的發(fā)酵底物很廣泛，利用工廠的含糖廢水（如制糖廠、啤酒廠等）、造紙廠富含纖維素廢水、面粉廠廢水、廚余垃圾等作為發(fā)酵底物進(jìn)行厭氧發(fā)酵制氫均有文獻(xiàn)報(bào)道。發(fā)酵產(chǎn)氫的菌種從最初的純菌發(fā)展到現(xiàn)在被廣泛使用的厭氧活性污泥和動(dòng)物糞便堆肥等混合菌種，既消除了純菌的雜菌污染問題，且來源方便降低產(chǎn)氫成本。但是厭氧發(fā)酵制氫會(huì)受到各種環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件因素的影響，如發(fā)酵液 pH值[3-4]及含量[5-9]、菌種來源及與處理方式等[10-12]，而并沒有文獻(xiàn)對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的主要影響因素進(jìn)行全面研究分析。因此，本研究對(duì)影響厭氧發(fā)酵制氫的主要因素進(jìn)行系統(tǒng)地研究討論，確定其影響效果，最終得到較適宜的產(chǎn)氫條件，實(shí)現(xiàn)提升產(chǎn)氫效率的目標(biāo)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　接種污泥

本研究采用厭氧活性污泥作為混合菌種，污泥取自天津市某污水處理廠。取回污泥后，在4℃下進(jìn)行冷藏保存待用。污泥 pH值為6.3，懸浮固體（SS）和揮發(fā)性懸浮固體（VSS）的含量分別為84.8%和8.2%。

1.2　模擬廢水組成

模擬含糖廢水的組成（g/L）為：葡萄糖：20，（NH4）2SO4：1.00 ～8.00，KH2PO4：1.50，CoCl2·6H2O：0.20，F(xiàn)eSO4：0 ～0.30，CaCl2·2H2O：0.10，MnCl2·6H2O：0.10，ZnCl2：0.05，Na2MoO4：0.01，Mg-SO4：0 ～0.05，NiCl2·6H2O：0.01。

1.3　單因素實(shí)驗(yàn)

利用單因素實(shí)驗(yàn)方法考察厭氧活性污泥熱處理溫度和時(shí)間、發(fā)酵液初始 pH值及和Mg2+濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫的影響。氫氣產(chǎn)率定義為1 mol葡萄糖所對(duì)應(yīng)的氫氣的物質(zhì)的量，mol/mol。

在考察某一影響因素時(shí)，其他因素的設(shè)定值分別為：熱處理溫度90℃、熱處理時(shí)間20 min、初始pH值： 8.0、 （NH4）2SO4、FeSO4和 MgSO4的濃度為2.00、0.20和0.01 g/L。在每一組單因素實(shí)驗(yàn)中，在保持其他因素取值不變的情況下改變所研究變量的取值。

在250 mL錐形瓶中加入15 g熱處理過的厭氧活性污泥作為混合菌種和200 mL模擬廢水作為發(fā)酵底物，在調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始pH值后用N2排除錐形瓶中的空氣，以形成厭氧環(huán)境，然后用膠塞密封錐形瓶口并置于35℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫，通過橡膠管將產(chǎn)生的氣體導(dǎo)入進(jìn)鋁箔氣袋中。進(jìn)行3組平行試驗(yàn)以降低實(shí)驗(yàn)誤差。

1.4　檢測方法

厭氧發(fā)酵產(chǎn)生氣體的組成通過Perkin Elmer XL型號(hào)的氣相色譜儀進(jìn)行檢測，配備熱導(dǎo)池檢測器，不銹鋼色譜柱柱長2.0 m，直徑3 mm，填充TDX-01（80/100目）；進(jìn)樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別為80、170和170℃；氮?dú)庾鬏d氣，氣速25 mL/min。液相末端發(fā)酵產(chǎn)物（VFAs）的含量通過Shimadzu型氣相色譜儀進(jìn)行測定，氫火焰檢測器，使用FFAP極性柱，柱長30 m，直徑0.32 mm；進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250℃；采用程序升溫：最初50℃保持2 min，然后以5℃/min的升溫速率升至200℃，最后在200℃保持10 min。采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法測量厭氧活性污泥懸浮固體（SS）和揮發(fā)性懸浮固體（VSS）[13]。使用pHS-3C型酸度計(jì)測量發(fā)酵液末態(tài)pH值。產(chǎn)出的氣體收集到鋁箔材料的集氣袋中，通過排水法測量氣體體積，然后再換算成標(biāo)準(zhǔn)體積。

2　結(jié)果與討論

2.1　污泥熱處理溫度和時(shí)間對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

對(duì)活性污泥進(jìn)行加熱處理，以抑制或殺死非產(chǎn)氫菌和耗氫菌，而產(chǎn)氫菌（梭菌、革蘭氏陽性菌、芽孢桿菌和棒桿菌等）能形成芽孢從而活性不受影響[14-16]。

在研究熱處理溫度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響時(shí)，在70～100℃間每增長5℃設(shè)置考察點(diǎn)，其他影響因素分別設(shè)定為：熱處理時(shí)間20 min、初始pH值為8.0、 （NH4）2SO4、FeSO4和 MgSO4的濃度為 2.00、0.20和0.01 g/L（在研究其他影響因素時(shí)，熱處理溫度設(shè)定為90℃）。

從圖1可以看出，在熱處理溫度90℃下，氫氣體積達(dá)到最大值570.2 mL，1 mol葡萄糖可產(chǎn)1.85 mol的氫氣。在產(chǎn)生的氣體中未檢測到甲烷氣體，說明熱處理方式有效地抑制了甲烷菌活性。隨著熱處理溫度升高，氫氣產(chǎn)量呈下降趨勢。這與文獻(xiàn)報(bào)道的最適宜熱處理溫度范圍80～95℃一致[17-18]。

圖1　熱處理溫度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響Fig.1 Perform ance of hyd rogen p roduction from glucose at different preheating tem peratu res

圖2　熱處理時(shí)間對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響Fig.2 Perform ance of hyd rogen p roduction from glucose with different p reheating duration

由圖2可見，在90℃下對(duì)厭氧活性污泥進(jìn)行40 min的熱處理，得到最大的產(chǎn)氫效率。而太長的熱處理時(shí)間造成產(chǎn)氫量的下降，當(dāng)處理時(shí)長達(dá)到100 min后，氫氣產(chǎn)量下降33%?？赡苁怯捎跓崽幚頊囟冗^高或時(shí)間過長會(huì)對(duì)活性污泥造成熱損傷，不利于發(fā)酵產(chǎn)氫。

2.2　發(fā)酵液初始pH值對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

發(fā)酵液初始pH值會(huì)影響微生物菌群組成和厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌的代謝途徑。從圖3可以看出在初始pH值8.0的條件下，氫氣體積、產(chǎn)率和體積分?jǐn)?shù)達(dá)到639.6 mL、2.14 mol/mol和0.777的最高值?？赡苁且?yàn)槿鯄A性條件可以在一定程度上中和酸性代謝產(chǎn)物（乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸），減少其通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的量，從而降低對(duì)微生物生長的抑制作用，最終提升產(chǎn)氫效率[19]。Bow les等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵液pH值降至5.0以下后，發(fā)酵產(chǎn)氫基本停止[20]，而吳小兵等[21]指出中性的pH值環(huán)境下有利于厭氧產(chǎn)氫菌保持高活性進(jìn)行糖化和厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的反應(yīng)過程。主要是因?yàn)閰捬醢l(fā)酵產(chǎn)氫過程所使用的菌種、發(fā)酵底物、操作參數(shù)的不同導(dǎo)致最適的初始pH值存在一定的差異。

圖3　發(fā)酵液初始pH值對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響Fig.3 Perform ance of hydrogen p roduction from glucose with d ifferent initial pH values

2.3　NH+4濃度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

氮元素是微生物固氮酶和產(chǎn)氫酶的重要組成元素，本研究使用（NH4）2SO4作為無機(jī)氮源，考察了不同濃度（NH4）2SO4加入量對(duì)厭氧活性污泥中菌群代謝活性和厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4　濃度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響Fig.4 Performance of hydrogen production from glucose with different concentrations of（NH 4）2 SO 4

2.4　Fe2+濃度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

相比無添加 FeSO4，當(dāng)加入0.10 g/L的 FeSO4時(shí)得到的氫氣產(chǎn)率提升了35%，主要是因?yàn)椋汗痰复呋倪€原反應(yīng)必須要有鉬鐵蛋白、鐵蛋白等作為電子轉(zhuǎn)移的載體；氫酶的主要成分是鐵硫蛋白，F(xiàn)e2+是產(chǎn)氫酶必不可少的組成元素。因此，F(xiàn)e2+的加入有助于提升微生物厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫效率。但隨著Fe2+濃度的繼續(xù)增大，產(chǎn)氫效率出現(xiàn)下降趨勢，有文獻(xiàn)證明過高的Fe2+會(huì)抑制氫酶活性[22]，因此圖5中FeSO4濃度達(dá)到0.10 g/L后，產(chǎn)氫量大幅下降。楊海軍[23]的研究結(jié)果認(rèn)為0.15 g/L的FeSO4濃度是最適合厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫的濃度，得到最大產(chǎn)氫體積225 mL，但過多的Fe2+會(huì)在一定程度上抑制發(fā)酵產(chǎn)氫。因此只有在適宜Fe2+濃度下才能促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)氫，利于產(chǎn)氫菌的生長代謝，提高產(chǎn)氫速率和產(chǎn)氫量。

圖5　Fe2+濃度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響Fig.5 Performance of hydrogen production from glucose with different concentrations of FeSO 4

2.5　Mg2+濃度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

從圖6可以看出，0.03 g/L的MgSO4是最適宜的濃度點(diǎn)，得到的最大的氫氣體積（574.18 mL）、最大產(chǎn)氫效率（2.35 mol/mol）以及最高氫氣體積分?jǐn)?shù)（0.822）分別比最小值高出 37.5%、46.7%和16.4%。當(dāng)MgSO4濃度小于0.03 g/L時(shí)，產(chǎn)氫量處于較低水平，可能是由于發(fā)酵液中低濃度的鎂離子不足以提供微生物細(xì)胞膜、細(xì)胞壁等的合成，從而降低了厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌群的生長，所以其產(chǎn)氫能力較低；當(dāng)MgSO4濃度過高，超過0.03 g/L時(shí)，出現(xiàn)了產(chǎn)氫量、產(chǎn)氫效率以及氫氣濃度下降的趨勢，推測可能的原因是糖酵解酶被高濃度的鎂離子抑制了代謝活性，進(jìn)而影響了厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氫能力。

2.6　最適宜條件下的產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)

圖6　Mg2+濃度對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響Fig.6 Perform ance of hyd rogen p roduction from glucose with different concentrations of MgSO 4

通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)各主要影響因素的研究，可以得到厭氧活性污泥利用葡萄糖作為發(fā)酵底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫的最適宜條件為：污泥在90℃下熱處理40 min，調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始 pH值至8.0，加入 3.00、0.10 和 0.03 g/L的（NH4）2SO4、FeSO4和 MgSO4。

在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示?？梢詫a(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)過程分為3個(gè)階段：在最初的8 h內(nèi)，氫氣產(chǎn)量較低，微生物處于適應(yīng)生長代謝環(huán)境階段，而在8～12 h內(nèi)迅速上升，產(chǎn)氫菌處于高活性期，在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诘? h內(nèi)產(chǎn)氫量出現(xiàn)大幅下降，可能是由于發(fā)酵液pH值降至酸性范圍內(nèi)[20]、各種無機(jī)元素含量下降等造成產(chǎn)氫環(huán)境不再適宜微生物進(jìn)行代謝產(chǎn)氫。

圖7　最適宜條件下厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Resu lts of anaerobic ferm entation hyd rogen p roduction under the op tim al conditions

在該條件下得到較高純度（體積分?jǐn)?shù)0.80）的氫氣630 mL，氫氣產(chǎn)率為 2.62 mol/mol（圖 7），比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中最高的氫氣產(chǎn)率2.41 mol/mol提高了8.7%，氫氣體積分?jǐn)?shù)提升到0.80，比張茂林等[24]使用活性污泥進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)得到的氫氣體積分?jǐn)?shù)最大值0.56高30%。因此通過本實(shí)驗(yàn)達(dá)到了提高氫氣產(chǎn)率和氫氣體積分?jǐn)?shù)、優(yōu)化產(chǎn)氫條件的目的。

3　結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫的主要影響因素進(jìn)行考察并總結(jié)出最適宜的產(chǎn)氫條件為：厭氧活性污泥熱處理溫度90℃，熱處理時(shí)間40 min，發(fā)酵液初始 pH值 8.0，（NH4）2SO43.00 g/L、FeSO40.10 g/L、MgSO40.03 g/L。在該最適宜條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，氫氣產(chǎn)率為2.62 mol/mol，比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中最高的氫氣產(chǎn)率2.41 mol/mol提高了8.7%，氫氣體積分?jǐn)?shù)高達(dá)0.80，說明通過本文的研究優(yōu)化厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫條件、提升了產(chǎn)氫效率和氫氣純度，是一種較為高效的制氫方法，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] Show K，Lee D，Chang J.Bioreactor and process design for biohydrogen production[J].Bioresource Technology，2011，102（18）： 8 524-8 533

[2] 任南琪，宮曼麗，邢德峰.連續(xù)流生物制氫反應(yīng)器乙醇型發(fā)酵的運(yùn)行特性[J].環(huán)境科學(xué)，2004（6）： 113-116 Ren Nanqi，Gong Manli，Xing Defeng.Continuous operation of hydrogen bio-production reactor with ethanoltype fermentation[J].Environmental Science，2004（6）： 113-116（in Chinese）

[3] Wu X，Li Q，Dieudonne M，et al.Enhanced H2gas production from bagasse using adhE inactivated Klebsiella oxytoca HP1 by sequential dark-photo fermentations[J].Bioresource Technology，2010，101 （24）：9 605-9 611

[4] Skonieczny M T，Yargeau V.Biohydrogen production from wastewater by Clostridium beijerinckii：Effect of pH and substrate concentration[J].International Journal of Hydrogen Energy，2009，34（8）： 3 288-3 294

[5] Bisaillon A，Turcot J，Hallenbeck P C.The effect of nutrient limitation on hydrogen production by batch cultures of Escherichia coli[J].International Journal of Hydrogen Energy，2006，31（11）： 1 504-1 508

[6] Yang H，Shen J.Effect of ferrous iron concentration on anaerobic bio-hydrogen production from soluble starch[J].International Journal of Hydrogen Energy，2006，31（15）： 2 137-2 146

[7] Salerno M B，Park W，Zuo Y，et al.Inhibition of biohydrogen production by ammonia[J].Water Research，2006，40（6）： 1 167-1 172

[8] Zhang Y，Liu G，Shen J.Hydrogen production in batch culture ofmixed bacteria with sucrose under different iron concentrations[J].International Journal of Hydrogen Energy，2005，30（8）： 855-860

[9] Liu B，Ren N，Ding J，et al.The effect of Ni2+，F(xiàn)e2+and Mg2+concentration on photo-hydrogen production by Rhodopseudomonas faecalis RLD-53[J].International Journal of Hydrogen Energy，2009，34（2）： 721-726

[10] Wang J，Wan W.Factors influencing fermentative hydrogen production：A review[J].International Journal of Hydrogen Energy，2009，34（2）： 799-811

[11] Li C，F(xiàn)ang H.Fermentative hydrogen production from wastewater and solid wastes by m ixed cultures[J].Critical Reviews in Environmental Science and Technology，2007，37（1）： 1-39

[12] Sreela-Or C，Imai T，Plangklang P，et al.Optimization of key factors affecting hydrogen production from food waste by anaerobic mixed cultures[J].International Journal of Hydrogen Energy，2011，36（21）： 14 120-14 133

[13] 國家環(huán)保局.水與廢水分析監(jiān)測方法[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002

[14] Mohammadi P，Ibrahim S，Mohamad A M S，et al.Effects of different pretreatment methods on anaerobic mixed microflora for hydrogen production and COD reduction from palm oil mill effluent[J].Journal of Cleaner Production，2011，19（14）： 1 654-1 658

[15] Chang S，Li J，Liu F.Evaluation of different pretreatmentmethods for preparing hydrogen-producing seed inocula from waste activated sludge[J].Renewable Energy，2011，36（5）： 1 517-1 522

[16] Cheng J，Su H，Zhou J，et al.Hydrogen production by mixed bacteria through dark and photo fermentation[J].International Journal of Hydrogen Energy，2011，36（1）： 450-457

[17] Wang Y，Ai P，Hu C，et al.Effects of various pretreatmentmethods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose[J].International Journal of Hydrogen Energy，2011，36（1）： 390-396

[18] Argun H，Kargi F.Effects of sludge pre-treatmentmethod on bio-hydrogen production by dark fermentation of waste ground wheat[J].International Journal of Hydrogen Energy，2009，34（20）： 8 543-8 548

[19] Fangkum A，Reungsang A.Biohydrogen production from sugarcane bagasse hydrolysate by elephant dung：Effects of initial pH and substrate concentration[J].International Journal of Hydrogen Energy，2011，36（14）：8 687-8 696

[20] Bow les L K，Ellefson W L.Effects of butanol on Clostridium acetobutylicum[J].Applied and Environ mental M icrobiology，1985，50（5）： 1 165-1 170

[21] Wu X，Li Q，Dieudonne M，et al.Enhanced H2gas production from bagasse using adhE inactivated Klebsiella oxytoca HP1 by sequential dark-photo fermentations[J].Bioresource Technology，2010，101 （24）：9 605-9 611

[22] Wang J，Wan W.Effect of Fe2+concentration on fermentative hydrogen production by mixed cultures[J].International Journal of Hydrogen Energy，2008，33（4）： 1 215-1 220

[23] Yang H，Shen J.Effect of ferrous iron concentration on anaerobic bio-hydrogen production from soluble starch[J].International Journal of Hydrogen Energy，2006，31（15）： 2 137-2 146

[24] Zhang mL，F(xiàn)an Y T，Xing Y，et al.Enhanced biohydrogen production from cornstalk wastes with acidification pretreatment by mixed anaerobic cultures[J].Biomass and Bioenergy，2007，31（4）：250-254