朱春華，林 甦，陳 珍，劉斌瓊，萬(wàn)春和，傅光華，黃 瑜

禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)(家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征[1]，該病毒由8個(gè)基因片段構(gòu)成，其中最短的一個(gè)基因?yàn)榉墙Y(jié)構(gòu)基因(non-structural gene，NS)。病毒復(fù)制過(guò)程中，NS基因編碼一個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本可被選擇性的剪切并表達(dá)兩個(gè)重要的功能蛋白，分別是 26 kDa的NS1蛋白和14 kDa的NEP(nuclear export protein，NEP)蛋白(通常被稱(chēng)為NS2蛋白)。NS1蛋白以二聚體形式存在，在病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，mRNA的合成、剪切、蛋白磷酸化甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡都與這個(gè)蛋白相關(guān)[2-3]。同時(shí)，有研究表明該蛋白在非特異性免疫反應(yīng)中會(huì)抑制Ⅰ型干擾素的合成[3]。NS1蛋白含有兩個(gè)核定位信號(hào)區(qū)，其中34～38位氨基酸殘基的Asp-Arg-Leu-Arg-Arg信號(hào)區(qū)非常保守，在所有的甲型流感病毒中都相同。第二個(gè)信號(hào)區(qū)位于203～230位氨基酸殘基處，大多數(shù)甲型流感病毒中都有這一序列[4]。NS1蛋白是決定AIV對(duì)感染細(xì)胞的破壞力的關(guān)鍵因素，影響AIV的致病性和毒力[5-6]；NS2具有調(diào)節(jié)非結(jié)構(gòu)蛋白合成的作用，在病毒感染細(xì)胞過(guò)程發(fā)揮重要的作用[3]。在細(xì)胞感染流感病毒的早期就可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)有大量的NS1聚集，細(xì)胞漿內(nèi)也有NS1聚集；而NS2合成較晚，主要存在于細(xì)胞漿，也可在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)[4]。

目前福建省分離的禽源流感毒株包括H5N1、H6N6、H9N2等亞型，本研究擬對(duì)福建省雞源、鴨源、鵝源等不同源的流感毒株的NS基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，進(jìn)一步探討福建省不同亞型之間和同一亞型內(nèi)不同毒株的NS基因與國(guó)內(nèi)代表株禽流感病毒NS基因的特性差異，為進(jìn)一步了解福建省不同亞型禽流感病毒的NS基因遺傳進(jìn)化關(guān)系及毒力變異奠定基礎(chǔ)，為深入了解流感病毒的致病機(jī)制與NS基因之間交互作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 9～10日齡SPF雞胚購(gòu)自北京梅利亞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。2株雞源禽流感病毒FZ-04、FZ-11株，5株鴨源禽流感病毒A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)、A/Duck/Fujian/FQ107/2007(H9N2)、A/duck/Fujian/MH/2003(H9N2)、A/Duck/Fujian/FZ01/08(H9N2)、A/Muscovy duck/Fujian/CL/1997(H9N2)[7-8]毒株均由本禽病室于1997-2011年從福建地區(qū)分離保存，毒株分離與增殖見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。大腸桿菌DH5α由本室保存。

1.2儀器和試劑 凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD)、PCR儀(Eppendorf 公司)，Trizol購(gòu)自Invitrogen。膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞自制。AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶和pMD18-T載體均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3引物設(shè)計(jì) FZ-04株禽流感病毒NS基因特異引物參考文獻(xiàn)[9]。反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-AGCAAAAGCAGG-3′。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4毒株NS基因擴(kuò)增 毒株分離、增殖以及病毒RNA提取詳見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。用流感的反轉(zhuǎn)錄引物Uni-12，按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增以cDNA為模板，反應(yīng)體系為50 μL：10×Buffer 5 μL，dNTP mixture (2.5 nmol/L)4 μL，Ex-Taq DNA polymerase 0.5 μL，引物(20 μmol/L)各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 37.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，按94 ℃30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.5NS基因的遺傳進(jìn)化分析 將毒株NS基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序。分別應(yīng)用DNAstar 5.0和MEGA 4.0分析軟件(By Clustal W Method)對(duì)NS基因序列與GenBank中登錄的國(guó)內(nèi)流感病毒典型代表株及福建省不同時(shí)期分離的H5N1、H9N2和H6N6亞型流感毒株進(jìn)行核苷酸序列同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。遺傳進(jìn)化分析所涉及的毒株見(jiàn)表1。

2 結(jié) 果

2.1NS基因核苷酸測(cè)序結(jié)果及核苷酸同源性分析 FZ-04、FZ-11毒株NS基因擴(kuò)增的長(zhǎng)度均為887 bp，GenBank基因登錄號(hào)分別為KF550969、KF550968。由DNAstar軟件分析可知，兩個(gè)毒株NS1基因完整的閱讀框?yàn)?54 bp(從27～680 bp)，編碼217個(gè)氨基酸；NS2 基因編碼區(qū)則由27～56 bp及529～864 bp構(gòu)成，共編碼121個(gè)氨基酸，不存在氨基酸缺失或插入現(xiàn)象。MegAlign軟件分析可知，F(xiàn)Z-04株與福建株CK/FJ/G9/09(H9N2)同源性最高(99.0%)，F(xiàn)Z-11株與廣西省馬源分離株EQ/GX/3/2011(H9N2)同源性最高(99.4%)。FZ-04，F(xiàn)Z-11毒株與福建H5N1毒株同源性分別為88.2%～89.3%，88.3%～89.2%；與福建H9N2毒株的同源性分別為92.7%～99.0%，93.2%～99.4%；與疫苗株CK/SD/6/96同源性分別為92.6%、93.2%，與國(guó)內(nèi)H5N1代表株GS/GD/1/96同源性最低，分別為70.8%和70.6%，與福建省H6N6代表株同源性分別為89.6%和90.1%。

2.2NS基因遺傳進(jìn)化分析 從遺傳進(jìn)化樹(shù)分析可知(圖1)，福建省H5、H9亞型禽流感毒株分別聚合在兩個(gè)不同的大分支上。GenBank中與本研究的兩株病毒NS基因親緣關(guān)系最近的毒株為 CK/FJ/G9/09株，與國(guó)內(nèi)高致病性禽流感代表株GS/GD/1/96遺傳距離最遠(yuǎn)，CK/BJ/1/94毒株位于進(jìn)化分析的根部，表明其余的H9N2亞型毒株都是該毒株與其他亞系毒株之間基因交流的產(chǎn)物。NS基因與廣西省馬源流感株EQ/GX/3/2011遺傳距離很近，可能是禽源流感病毒基因重組后感染了馬類(lèi)造成的[10]。

福建省禽流感NS1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖2和表2)，F(xiàn)Z-04和FZ-11毒株NS1蛋白羧基末端存在13個(gè)氨基酸缺失，與福建省分離的H9N2亞型毒株序列長(zhǎng)度相同，而福建省H5N1毒株NS1蛋白80-84位有5個(gè)氨基酸缺失，總長(zhǎng)度為225 bp。本研究中福建省H9N2毒株的NS1蛋白羧基端不存在PL基序(ESEV/EPEV)，而國(guó)內(nèi)首次分離的高致病性GS/GD/1/96代表株和福建9株H5N1病毒SW/FJ/F1/01、GS/FJ/bb/03、CK/FJ/9821/05等存在ESEV基序，有一株病毒CK/FJ/1/07(H5N1)則呈現(xiàn)GSEV遺傳多態(tài)性。

表1 本研究所涉及的毒株

圖1 NS基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

根據(jù)NS基因核苷酸同源性不同分為A和B兩個(gè)等位基因群，群內(nèi)同源性相對(duì)比較高。A群包含禽源和哺乳動(dòng)物源流感病毒，而B(niǎo)群主要包含禽源流感病毒和一種馬流感[11-12]，有研究報(bào)道A等位基因群中歐亞H9N2亞型流感毒株又被分為3個(gè)不同的亞群，分別為DK/HK/Y280/97株為代表的Y280亞群、DK/HK/Y439/97株為代表的Y439亞群及QA/HK/G1/97株為代表的G1亞群。本研究中所涉及的毒株GS/GD/1/96屬于B等位基因群，其他的都屬于A等位基因群。根據(jù)GenBank提交的序列信息可知，福建省分離的禽源流感毒株目前已見(jiàn)報(bào)道的有3種亞型，分別是H5N1、H9N2和H6N6亞型，福建H9N2亞型毒株都屬于Y280亞群，而福建H5N1流感毒株則屬于Y439亞群，H6N6亞型鴨源DK/FJ/FZ01/08株則是獨(dú)立的一分支。

本研究中FZ-04和FZ-11的NS1基因編碼217個(gè)氨基酸，其羧基末端存在13個(gè)氨基酸缺失，早期報(bào)道野外分離的禽流感病毒的某些毒株，NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失現(xiàn)象，而近幾年研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)低致病性毒株羧基端存在氨基酸缺失現(xiàn)象，本研究中福建省H9N2毒株都存在羧基末端氨基酸缺失現(xiàn)象，與其亞群代表株Y280不同，Y280株不存在基因缺失現(xiàn)象。令人感興趣的是，本研究的21株病毒中僅福建H5N1高致病性流感毒株NS1蛋白80-84位有5個(gè)氨基酸缺失(圖2)，而H9N2亞型毒株和H6N6毒株在這幾個(gè)位點(diǎn)不存在缺失現(xiàn)象，這是否可作為福建省區(qū)分高致病性和低致病性禽流感病毒的標(biāo)志之一，有待于進(jìn)一步研究。近年來(lái)關(guān)于NS1蛋白這幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸缺失的報(bào)道比較多，歐新華等[13]報(bào)道從湖南長(zhǎng)沙市禽類(lèi)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分離到8株H5N1病毒的NS1蛋白80-84位點(diǎn)均存在氨基酸缺失。

圖2 禽流感病毒NS1氨基酸序列比對(duì)

Fig.2ComparisononaminoacidsequenceofNS1ofavianinfluenzaviruses

In the figure, dots indicate residues identical to those of the FZ-04 strain; dashes indicate the deletion positions.

表2 福建省禽流感NS1氨基酸位點(diǎn)分析

Note: Dashes indicate the deletion positions in the table.

福建省AIV的NS1氨基酸序列中有11個(gè)氨基酸位點(diǎn)高度保守(分別是第55、69、77、87、103、106、118、129、143、152和185位)，已有研究證實(shí)第69位和第77位氨基酸位點(diǎn)突變會(huì)影響NS蛋白正確的亞細(xì)胞定位，從而減弱病毒的復(fù)制能力[14]；同時(shí)，有研究報(bào)道稱(chēng)103、106位氨基酸位點(diǎn)分別從L(亮氨酸)突變成F(苯丙氨酸)和I(異亮氨酸)突變成M(蛋氨酸)，將會(huì)增強(qiáng)禽源和人源流感毒株的毒力[15]，其他7個(gè)氨基酸位點(diǎn)在不同亞型上(H5N1或H9N2)氨基酸不同，而同一亞型內(nèi)(H5N1或H9N2)的毒株的7個(gè)氨基酸位點(diǎn)相同(見(jiàn)表2)，這是否能夠成為福建省高致病性H5N1株和低致病性H9N2株流感病毒的區(qū)分標(biāo)志之一，有待于后續(xù)深入研究。本研究中僅QA/HK/G1/97株NS蛋白92位氨基酸為E(谷氨酸)， 其他毒株該位點(diǎn)氨基酸均為D(天冬氨酸)，有研究分析該位點(diǎn)由D突變?yōu)镋，會(huì)降低NS1蛋白磷酸化程度，并增強(qiáng)NS1對(duì)dsRNA的結(jié)合能力，從而提高病毒對(duì)干擾素的抗性[5,16]。因此，研究禽流感病毒NS基因遺傳進(jìn)化關(guān)系，有助于進(jìn)一步了解福建省流感病毒變異情況，為深入了解流感病毒的致病機(jī)制與NS基因間交互作用提供理論依據(jù)。

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