亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        福建省禽流感病毒非結構蛋白基因特征分析

        2014-04-09 00:58:00朱春華劉斌瓊萬春和傅光華
        中國人獸共患病學報 2014年3期
        關鍵詞:流感病毒毒株禽流感

        朱春華,林 甦,陳 珍,劉斌瓊,萬春和,傅光華,黃 瑜

        禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征[1],該病毒由8個基因片段構成,其中最短的一個基因為非結構基因(non-structural gene,NS)。病毒復制過程中,NS基因編碼一個mRNA轉錄本,該轉錄本可被選擇性的剪切并表達兩個重要的功能蛋白,分別是 26 kDa的NS1蛋白和14 kDa的NEP(nuclear export protein,NEP)蛋白(通常被稱為NS2蛋白)。NS1蛋白以二聚體形式存在,在病毒的復制過程中發(fā)揮著重要的作用,mRNA的合成、剪切、蛋白磷酸化甚至誘導細胞凋亡都與這個蛋白相關[2-3]。同時,有研究表明該蛋白在非特異性免疫反應中會抑制Ⅰ型干擾素的合成[3]。NS1蛋白含有兩個核定位信號區(qū),其中34~38位氨基酸殘基的Asp-Arg-Leu-Arg-Arg信號區(qū)非常保守,在所有的甲型流感病毒中都相同。第二個信號區(qū)位于203~230位氨基酸殘基處,大多數(shù)甲型流感病毒中都有這一序列[4]。NS1蛋白是決定AIV對感染細胞的破壞力的關鍵因素,影響AIV的致病性和毒力[5-6];NS2具有調節(jié)非結構蛋白合成的作用,在病毒感染細胞過程發(fā)揮重要的作用[3]。在細胞感染流感病毒的早期就可發(fā)現(xiàn)細胞核內有大量的NS1聚集,細胞漿內也有NS1聚集;而NS2合成較晚,主要存在于細胞漿,也可在細胞核內發(fā)現(xiàn)[4]。

        目前福建省分離的禽源流感毒株包括H5N1、H6N6、H9N2等亞型,本研究擬對福建省雞源、鴨源、鵝源等不同源的流感毒株的NS基因進行遺傳進化分析,進一步探討福建省不同亞型之間和同一亞型內不同毒株的NS基因與國內代表株禽流感病毒NS基因的特性差異,為進一步了解福建省不同亞型禽流感病毒的NS基因遺傳進化關系及毒力變異奠定基礎,為深入了解流感病毒的致病機制與NS基因之間交互作用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1材料 9~10日齡SPF雞胚購自北京梅利亞實驗動物有限公司。2株雞源禽流感病毒FZ-04、FZ-11株,5株鴨源禽流感病毒A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)、A/Duck/Fujian/FQ107/2007(H9N2)、A/duck/Fujian/MH/2003(H9N2)、A/Duck/Fujian/FZ01/08(H9N2)、A/Muscovy duck/Fujian/CL/1997(H9N2)[7-8]毒株均由本禽病室于1997-2011年從福建地區(qū)分離保存,毒株分離與增殖見文獻[8]。大腸桿菌DH5α由本室保存。

        1.2儀器和試劑 凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD)、PCR儀(Eppendorf 公司),Trizol購自Invitrogen。膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自美國Omega Bio-Tek公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞自制。AMV反轉錄酶、Ex Taq DNA聚合酶和pMD18-T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司。

        1.3引物設計 FZ-04株禽流感病毒NS基因特異引物參考文獻[9]。反轉錄引物序列為5′-AGCAAAAGCAGG-3′。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

        1.4毒株NS基因擴增 毒株分離、增殖以及病毒RNA提取詳見文獻[8]。用流感的反轉錄引物Uni-12,按照AMV反轉錄酶說明書進行反轉錄合成cDNA。PCR擴增以cDNA為模板,反應體系為50 μL:10×Buffer 5 μL,dNTP mixture (2.5 nmol/L)4 μL,Ex-Taq DNA polymerase 0.5 μL,引物(20 μmol/L)各1 μL,模板cDNA 1 μL,ddH2O 37.5 μL。反應條件:94 ℃預變性5 min,按94 ℃30 s,55 ℃ 35 s,72 ℃ 2 min,進行35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。取5 μL產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

        1.5NS基因的遺傳進化分析 將毒株NS基因的PCR產物經切膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接,轉化DH5α感受態(tài)細胞,PCR方法鑒定重組質粒,陽性質粒送大連寶生物公司測序。分別應用DNAstar 5.0和MEGA 4.0分析軟件(By Clustal W Method)對NS基因序列與GenBank中登錄的國內流感病毒典型代表株及福建省不同時期分離的H5N1、H9N2和H6N6亞型流感毒株進行核苷酸序列同源性比較和遺傳進化分析。遺傳進化分析所涉及的毒株見表1。

        2 結 果

        2.1NS基因核苷酸測序結果及核苷酸同源性分析 FZ-04、FZ-11毒株NS基因擴增的長度均為887 bp,GenBank基因登錄號分別為KF550969、KF550968。由DNAstar軟件分析可知,兩個毒株NS1基因完整的閱讀框為654 bp(從27~680 bp),編碼217個氨基酸;NS2 基因編碼區(qū)則由27~56 bp及529~864 bp構成,共編碼121個氨基酸,不存在氨基酸缺失或插入現(xiàn)象。MegAlign軟件分析可知,F(xiàn)Z-04株與福建株CK/FJ/G9/09(H9N2)同源性最高(99.0%),F(xiàn)Z-11株與廣西省馬源分離株EQ/GX/3/2011(H9N2)同源性最高(99.4%)。FZ-04,F(xiàn)Z-11毒株與福建H5N1毒株同源性分別為88.2%~89.3%,88.3%~89.2%;與福建H9N2毒株的同源性分別為92.7%~99.0%,93.2%~99.4%;與疫苗株CK/SD/6/96同源性分別為92.6%、93.2%,與國內H5N1代表株GS/GD/1/96同源性最低,分別為70.8%和70.6%,與福建省H6N6代表株同源性分別為89.6%和90.1%。

        2.2NS基因遺傳進化分析 從遺傳進化樹分析可知(圖1),福建省H5、H9亞型禽流感毒株分別聚合在兩個不同的大分支上。GenBank中與本研究的兩株病毒NS基因親緣關系最近的毒株為 CK/FJ/G9/09株,與國內高致病性禽流感代表株GS/GD/1/96遺傳距離最遠,CK/BJ/1/94毒株位于進化分析的根部,表明其余的H9N2亞型毒株都是該毒株與其他亞系毒株之間基因交流的產物。NS基因與廣西省馬源流感株EQ/GX/3/2011遺傳距離很近,可能是禽源流感病毒基因重組后感染了馬類造成的[10]。

        福建省禽流感NS1氨基酸序列比對結果(圖2和表2),F(xiàn)Z-04和FZ-11毒株NS1蛋白羧基末端存在13個氨基酸缺失,與福建省分離的H9N2亞型毒株序列長度相同,而福建省H5N1毒株NS1蛋白80-84位有5個氨基酸缺失,總長度為225 bp。本研究中福建省H9N2毒株的NS1蛋白羧基端不存在PL基序(ESEV/EPEV),而國內首次分離的高致病性GS/GD/1/96代表株和福建9株H5N1病毒SW/FJ/F1/01、GS/FJ/bb/03、CK/FJ/9821/05等存在ESEV基序,有一株病毒CK/FJ/1/07(H5N1)則呈現(xiàn)GSEV遺傳多態(tài)性。

        表1 本研究所涉及的毒株

        圖1 NS基因的遺傳進化樹

        3 討 論

        根據(jù)NS基因核苷酸同源性不同分為A和B兩個等位基因群,群內同源性相對比較高。A群包含禽源和哺乳動物源流感病毒,而B群主要包含禽源流感病毒和一種馬流感[11-12],有研究報道A等位基因群中歐亞H9N2亞型流感毒株又被分為3個不同的亞群,分別為DK/HK/Y280/97株為代表的Y280亞群、DK/HK/Y439/97株為代表的Y439亞群及QA/HK/G1/97株為代表的G1亞群。本研究中所涉及的毒株GS/GD/1/96屬于B等位基因群,其他的都屬于A等位基因群。根據(jù)GenBank提交的序列信息可知,福建省分離的禽源流感毒株目前已見報道的有3種亞型,分別是H5N1、H9N2和H6N6亞型,福建H9N2亞型毒株都屬于Y280亞群,而福建H5N1流感毒株則屬于Y439亞群,H6N6亞型鴨源DK/FJ/FZ01/08株則是獨立的一分支。

        本研究中FZ-04和FZ-11的NS1基因編碼217個氨基酸,其羧基末端存在13個氨基酸缺失,早期報道野外分離的禽流感病毒的某些毒株,NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失現(xiàn)象,而近幾年研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)低致病性毒株羧基端存在氨基酸缺失現(xiàn)象,本研究中福建省H9N2毒株都存在羧基末端氨基酸缺失現(xiàn)象,與其亞群代表株Y280不同,Y280株不存在基因缺失現(xiàn)象。令人感興趣的是,本研究的21株病毒中僅福建H5N1高致病性流感毒株NS1蛋白80-84位有5個氨基酸缺失(圖2),而H9N2亞型毒株和H6N6毒株在這幾個位點不存在缺失現(xiàn)象,這是否可作為福建省區(qū)分高致病性和低致病性禽流感病毒的標志之一,有待于進一步研究。近年來關于NS1蛋白這幾個位點氨基酸缺失的報道比較多,歐新華等[13]報道從湖南長沙市禽類農貿市場分離到8株H5N1病毒的NS1蛋白80-84位點均存在氨基酸缺失。

        圖2 禽流感病毒NS1氨基酸序列比對

        Fig.2ComparisononaminoacidsequenceofNS1ofavianinfluenzaviruses

        In the figure, dots indicate residues identical to those of the FZ-04 strain; dashes indicate the deletion positions.

        表2 福建省禽流感NS1氨基酸位點分析

        Note: Dashes indicate the deletion positions in the table.

        福建省AIV的NS1氨基酸序列中有11個氨基酸位點高度保守(分別是第55、69、77、87、103、106、118、129、143、152和185位),已有研究證實第69位和第77位氨基酸位點突變會影響NS蛋白正確的亞細胞定位,從而減弱病毒的復制能力[14];同時,有研究報道稱103、106位氨基酸位點分別從L(亮氨酸)突變成F(苯丙氨酸)和I(異亮氨酸)突變成M(蛋氨酸),將會增強禽源和人源流感毒株的毒力[15],其他7個氨基酸位點在不同亞型上(H5N1或H9N2)氨基酸不同,而同一亞型內(H5N1或H9N2)的毒株的7個氨基酸位點相同(見表2),這是否能夠成為福建省高致病性H5N1株和低致病性H9N2株流感病毒的區(qū)分標志之一,有待于后續(xù)深入研究。本研究中僅QA/HK/G1/97株NS蛋白92位氨基酸為E(谷氨酸), 其他毒株該位點氨基酸均為D(天冬氨酸),有研究分析該位點由D突變?yōu)镋,會降低NS1蛋白磷酸化程度,并增強NS1對dsRNA的結合能力,從而提高病毒對干擾素的抗性[5,16]。因此,研究禽流感病毒NS基因遺傳進化關系,有助于進一步了解福建省流感病毒變異情況,為深入了解流感病毒的致病機制與NS基因間交互作用提供理論依據(jù)。

        參考文獻:

        [1]Gan MH. Avian influenza[M]. Bejing: Beijing Agricultural University Press, 1995: 74. (in Chinese)

        甘孟侯. 禽流感[M]. 北京:北京農業(yè)大學出版社,1995:74.

        [2]Hale BG, Randall RE, Ortin J, et al. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses[J]. J Gen Virol, 2008, 89(10): 2359-2376. DOI: 10.1099/vir.0.2008/004606-0

        [3]Chervyakova OV, Strochkov VM, Sultankulova KT, et al. Molecular and genetic analysis of NS gene from high pathogenic strains of the avian influenza (H5N1) virus isolated in Kazakhstan[J]. Gene, 2011, 476(1-2): 15-19. DOI: 10.1016/j.gene.2011.02.003

        [4]Yin Z, Liu JH. Animal virology[M]. 2nded. Beijing: Science Press, 1997: 581. (in Chinese)

        殷震,劉景華. 動物病毒學[M]. 北京:科學出版社,1997:581.

        [5]Li JL, Chen EL, Li HP, et al. Genetic analysis of the nonstructural gene (NS1) of H9N2 avian influenza viruses isolated in China[J]. Chin J Virol, 2008,24(3): 220-226. (in Chinese)

        李建麗,陳恩林,李和平,等. H9N2亞型禽流感病毒NS1基因的進化分析[J]. 病毒學報, 2008,24(3): 220-226.

        [6]Salvatore M, Basler CF, Parisien JP, et al. Effects of influenza A virus NS1 protein on protein expression: the NS1 protein enhances translation and is not required for shutoff of host protein synthesis[J]. J Virol, 2002, 76(3): 1206-1212. DOI: 10.1128/JVI.76.3.1206-1212.2002

        [7]Wan CH, Fu GH, Cheng LF, et al. Sequence comparison of the hemagglutinin gene of the duck-origin H9N2 subtype avian influenza viruses[J]. Chin J Virol, 2012, 28(2): 158-164. (in Chinese)

        萬春和,傅光華,程龍飛,等. 鴨源H9N2 AIV血凝素基因序列比較[J]. 病毒學報, 2012,28(2): 158-164.

        [8]Zhu CH, Jiang B, Liu BQ, et al. Isolation and preliminary identification of H9 subtype influenza A viruses[J]. Fujian J Agr Sci, 2011, 26(4): 537-540. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0384.2011.04.007 (in Chinese)

        朱春華,江斌,劉斌瓊,等. H9亞型禽流感病毒的分離及初步鑒定[J]. 福建農業(yè)學報,2011,26(4):537-540.

        [9]Wan CH, Fu GH, Cheng LF, et al. Sequencing of the eight genes of A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007 (H9N2) Subtype avian influenza virus and their phylogenetic analysis[J]. J Agr Biotech, 2009, 17(5): 750-757. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2009.05.002 (in Chinese)

        萬春和,傅光華,程龍飛,等. A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007(H9N2)禽流感病毒8基因測序及遺傳進化分析[J]. 農業(yè)生物技術學報, 2009,17(5):750-757.

        [10]Kawaoka Y, Gorman OT, Ito T, et al. Influence of host species on the evolution of the nonstructural (NS) gene of influenza A viruses[J]. Virus Res, 1998, 55(2): 143-156. DOI: 10.1016/S0168-1702(98)00038-0

        [11]Wang S, Shi WM, Mweene A, et al. Genetic analysis of the nonstructural (NS) genes of H9N2 chicken influenza viruses isolated in China during 1998-2002[J]. Virus Genes, 2005, 31(3): 329-335. DOI: 10.1007/s11262-005-3251-2

        [12]Ludwig S, Schultz U, Mandler J, et al. Phylogenetic relationship of the nonstructural (NS) genes of influenza A viruses[J]. Virology, 1991, 183(2): 566-577. DOI: 10.1016/0042-6822(91)90985-k

        [13]Ou XH, Zhang RS, Song KY, et al. Genetic analysis of the NS genes of H5N1 avian influenza viruses isolated from sewage in poultry markets[J]. Chin J Virol, 2012, 28(3): 265-271. (in Chinese)

        歐新華,張如勝,宋克云,等. 家禽市場污水來源的H5N1亞型禽流感病毒NS基因分析[J]. 病毒學報,2012,28(3):265-271.

        [14]Li W, Noah JW, Noah DL. Alanine substitutions within a linker region of the influenza A virus non-structural protein 1 alter its subcellular localization and attenuate virus replication[J]. J Gen Virol, 2011, 92(8): 1832-1842. DOI: 10.1099/vir.0.031336-0

        [15]Dankar SK, Wang S, Ping J, et al. Influenza A virus NS1 gene mutations F103L and M106I increase replication and virulence[J]. Virol J, 2011, 8: 13. DOI:10.1186/1743-422X-8-13

        [16]Lipatov AS, Andreansky S, Webby RJ, et al. Pathogenesis of Hong Kong H5N1 influenza virus NS gene reassortants in mice: the role of cytokines and B- and T-cell responses[J]. J Gen Virol, 2005, 86(4): 1121-1130. DOI:10.1099/vir.0.80663-0

        猜你喜歡
        流感病毒毒株禽流感
        法國發(fā)現(xiàn)新冠新變異毒株IHU
        科學大觀園(2022年2期)2022-01-23 11:05:15
        抗甲型流感病毒中藥活性成分的提取
        防治H7N9 禽流感 家長知多少
        啟蒙(3-7歲)(2017年4期)2017-06-15 20:28:55
        高原地區(qū)流感病毒培養(yǎng)的條件優(yōu)化
        流感病毒分子檢測技術的研究進展
        基于HRP直接標記的流感病毒H1N1電化學免疫傳感器
        廣西鴨圓環(huán)病毒流行毒株遺傳變異分析
        牛傳染性鼻氣管炎IBRV/JZ06-3基礎毒株毒力返強試驗
        特產研究(2014年4期)2014-04-10 12:54:12
        豬瘟強毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測
        雞大腸桿菌病并發(fā)禽流感的診治
        日本亚洲欧美在线观看| 久久精品国产清自在天天线| 成人国产一区二区三区av| 国产成人无码精品久久久免费| 男人女人做爽爽18禁网站| 国产人在线成免费视频| 亚洲熟女av中文字幕网站| 亚洲国产av一区二区三| 久久av不卡人妻出轨一区二区| 日本真人做爰免费视频120秒| 日本三级欧美三级人妇视频| 国产一线视频在线观看高清| 区一区二区三免费观看视频 | 亚洲国产色图在线视频| 亚洲一区精品在线中文字幕| 中文字幕日韩一区二区不卡| 91精品国产综合成人| 青青国产成人久久91| 国产不卡在线免费视频| 亚洲精品在线免费视频| 天天躁日日躁狠狠躁欧美老妇| 日韩毛片基地一区二区三区| 99久久国产一区二区三区| 日韩不卡的av二三四区| 色综合久久中文娱乐网| 精品少妇ay一区二区三区| 日韩精品精品一区二区三区| 国产自拍偷拍视频免费在线观看| 欧美一性一乱一交一视频| 欧美三级免费网站| 久久久99精品视频| 漂亮人妻出轨中文字幕| 国产精品久久777777| 亚洲国产精品国自产电影| 国产一区二三区中文字幕| 人妻 丝袜美腿 中文字幕 | 无码日韩人妻AV一区免费| 综合中文字幕亚洲一区二区三区 | 人妻聚色窝窝人体www一区| 久久久亚洲欧洲日产国产成人无码| 一区二区三区视频免费观看在线|