李 歡,孫 菲,文 嵐,王曉春
瘧疾是最嚴重的全球性公共健康問題之一,世界上超過一半的人口生活在瘧疾流行區(qū)。近年來我國輸入性瘧疾呈逐年上升趨勢,2011年[1]全國27個省(市、區(qū))報告病例數4 479例,輸入病例占66.4%,死亡病例33例。湖南省報告148例,主要為惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum,P.f)和間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax,P.v)感染。目前我國仍采用顯微鏡檢法作為診斷瘧疾的“金標準”,顯微鏡檢法受鏡檢人員的主觀判斷及責任心影響,極容易漏診,延誤治療。為提升對瘧疾病例的實驗室復核和確診能力,近年來以PCR為基礎的分子生物學診斷技術發(fā)展迅速。污染風險低、靈敏度及特異性高的Real-time PCR[2]需要昂貴的儀器及試劑,難以在基層疾控部門推廣。本研究通過對多重PCR與傳統顯微鏡檢法的比較,旨在建立一種簡便快速、適于在基層疾控部門推廣的瘧疾確診方法。
1.1樣本與試劑 本研究采用的樣本包括DNA樣本和全血標本。惡性瘧原蟲(3D7)、間日瘧原蟲(Sal-1)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae,P.m)(Uganda I)及卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale,P.o)(Nigeria I)DNA由長沙市疾控中心惠贈。從長沙市芙蓉區(qū)疾控中心、長沙市疾控中心、中南大學湘雅醫(yī)院、中南大學湘雅二醫(yī)院、中南大學湘雅三醫(yī)院等收集疑似瘧疾臨床全血標本共86份,血片由湖南國際旅行衛(wèi)生保健中心同一專家進行顯微鏡檢診斷。DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司,PCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司,pGM-T克隆試劑盒與質粒抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。
1.2方法
1.2.1引物設計 從GenBank檢索P.f和P.v的18S rRNA序列,結合參考文獻[3]用Primer 5.0設計引物,并進行BLAST序列比對驗證引物特異性。引物由上海生工生物有限公司進行合成及ULTRAPAGE純化。引物序列見表1。
表1 多重PCR引物序列
1.2.2DNA的提取 吸取100 μL EDTA抗凝全血于1.5 mL eppendorf管中,用QIAGEN的QIAamp DNA Micro Kit試劑盒按照說明書提取DNA,經過裂解、上柱吸附、脫鹽等步驟,最后用100 μL elution buffer洗脫DNA。用瓊脂糖凝膠電泳法及紫外分光光度法檢測所提DNA的純度及濃度。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3單重PCR 將引物稀釋至10 μmoL/L,對引物濃度進行優(yōu)化,優(yōu)化后的反應體系為:2×Taq Master Mix(含染料)25 μL,引物PRvf 0.5 μL,引物PRv或PRf 0.5 μL,DNA 5 μL,用RNase-Free ddH2O補足50 μL。對退火溫度進行優(yōu)化,優(yōu)化后的反應條件為:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)35次,最后72 ℃延伸5 min,4 ℃結束PCR擴增。取PCR產物6 μL,用25 g /L 瓊脂糖凝膠進行電泳,凝膠成像系統中觀察擴增結果。回收、純化PCR產物,送至上海生工生物技術服務有限公司進行測序。
1.2.4多重PCR 將P.f DNA與P.v DNA按照1∶1的比例混合,標為Pvf。對引物濃度進行優(yōu)化,優(yōu)化后的反應體系為:2×Taq Master Mix(含染料)25 μL,引物PRvf 1.0 μL,引物PRv 0.5 μL,引物PRf 0.5 μL,DNA 5 μL,用RNase-Free ddH2O補足50 μL。反應條件同單重PCR。
1.2.5最低檢測限檢測 將P.f、P.v的擴增片段分別插入pGM -T 載體,按試劑盒說明書進行連接、轉化和篩選,進行菌落PCR初步驗證插入片段是否正確,提取陽性質粒DNA,用紫外分光光度計測定核酸濃度,并計算每微升的拷貝數。以質粒DNA作為標準品,進行10倍梯度稀釋。分別取濃度為101~ 107copies /μL 的標準品進行PCR,25 g /L 瓊脂糖凝膠電泳進行產物的檢測。
1.2.6臨床標本的檢測 對86例臨床全血標本進行多重PCR檢測,反應體系與反應條件與上文相同。多重PCR檢測結果與湖南國際旅行衛(wèi)生保健中心的顯微鏡檢結果進行比較。
1.2.7統計學方法 應用SPSS 17.0進行統計數據分析,采用配對四格表資料χ2檢驗。P<0.05為兩種方法有差別。以鏡檢法為金標準,計算多重PCR檢測臨床標本的靈敏度等指標。
2.1DNA純度及濃度 紫外分光光度法測得所有DNA樣本A260/A280均在1.8~2.0之間,表明DNA純度較高。
2.2PCR檢測結果 單重PCR可擴增出431 bp(P.f)和341 bp(P.v)目的條帶。多重PCR能擴增出模擬混合感染標本Pvf,P.m及P.o無條帶,特異性好。見圖1。
圖1單重與多重PCR產物條帶
Fig.1ProductbandsofsinglePCRandmultiplexPCR
1: Single PCRP.f(431 bp); 2: Single PCRP.v(341bp); 3: Multiplex PCRP.f; 4: Multiplex PCRP.v; 5: Multiplex PCR pvf; 6:P.m;
7:P.o; 8: NTC; M: Marker
2.3最低檢測限檢測 對P.v質粒標準品進行PCR檢測的凝膠電泳圖顯示,體系中標準品濃度為103copies/μL時仍有明顯條帶,該反應體系中標準品終濃度為102copies/反應。見圖2。
圖2間日瘧原蟲梯度稀釋標準品的PCR產物條帶(341bp)
Fig.2PCRproductbandsofP.vgradientdilutedstandardplasmids
M: Marker; 1: 107copies/μL; 2: 106copies/μL; 3: 105copies/μL; 4: 104copies/μL; 5: 103copies/μL; 6: 102copies/μL; 7: 101copies/μL; 8: NTC.
2.4臨床標本檢測 對86例臨床標本進行檢測,兩種方法檢測結果的比較見表2。鏡檢法檢出40例P.f(見表3)、22例P.v(見表4),多重PCR檢出45例P.f、20例P.v。
表2 兩種方法檢測結果比較
Note: χ2=0.364,P=0.549>0.05,兩種方法檢測結果無差別。
表3 兩種方法檢出P.f的比較
Note:P=0.180,P>0.05,兩種方法檢出P.f的結果無差別
瘧疾是一種極具破壞性的寄生蟲病,且近年來P.f對多種抗瘧藥產生抗藥性,宿主蚊亦對殺蟲劑產生抗藥性。及時、準確的診斷對實現瘧疾的控制與消除計劃具有重要意義。瘧疾的確診有賴于實驗室病原學診斷,傳統的鏡檢法結果受諸多因素影響,容易誤診或漏診,作為“金標準”已越來越難于評價診斷效率[4]。本研究所采用的多重PCR法可快速檢測出是否存在瘧原蟲感染,并可單管多檢,通過一次檢測即可鑒別P.f與P.v,兩種瘧原蟲目的片段長度相差90 bp,通過瓊脂糖凝膠電泳后容易分辨。操作簡便,快速經濟,不需要昂貴的儀器與試劑。相對于real-time PCR[5]更適合在基層疾控部門應用。與Singh B等[6]所述的巢式PCR相比較操作更簡單、更快速。我國瘧疾患者P.f與P.v感染較常見,而P.f對氯喹等耐藥,若缺乏及時有效的治療很容易轉化為兇險型發(fā)作,危及生命。因此對P.f與P.v進行鑒別對醫(yī)生正確使用抗瘧藥,瘧疾患者得到有效治療有著重要的意義。
表4 兩種方法檢出P.v的比較
Note:P=0.754,P>0.05,兩種方法檢出P.v的結果無差別。
在本研究中,對多重PCR反應的引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化,在優(yōu)化了反應條件下,對4種感染人的瘧原蟲DNA進行檢測,能檢出P.f和P.v,不常見的P.o和P.m無特異性條帶。對梯度稀釋的質粒標準品進行檢測,結果顯示最低檢測限為102copies/反應,與以往報道[7-8]所述多重PCR的最低檢測限相同。
對臨床標本檢測結果顯示多重PCR敏感度高,陽性預測值與陰性預測值均大于80%。該方法特異度僅為70.83%,主要是由于多重PCR可檢出102copies/反應的瘧原蟲,但原蟲密度低時(<50/μL)鏡檢法容易漏診[9]。本研究不足之處在于沒有條件對結果不一致的標本用鏡檢法進行復檢。郭傳坤[10]等對PCR法與鏡檢法結果不一致的血片進行復檢證實多數屬于鏡檢法的誤判。因此,原蟲密度低時若只進行顯微鏡檢易漏診,延誤治療。本研究所采用的多重PCR同時檢測P.f和P.v的方法,無需昂貴的儀器與試劑,操作簡便、相對快速經濟,對這2種瘧原蟲感染具有確診價值,為基層疾病控部門進行瘧疾的流行病學調查提供手段,有助于及早發(fā)現瘧疾患者,并準確分型,為臨床用藥及療效觀察提供參考。
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