范彥雷，李 立，婁忠子，閆鴻斌，賈萬忠

泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)，又稱泡型包蟲病，是由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis, Em)的幼蟲引起的一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，可感染包括人在內(nèi)的多種動物，呈世界性分布。目前該病呈現(xiàn)感染地區(qū)以及感染宿主擴增的趨勢，在一些非流行區(qū)的國家和地區(qū)也首次出現(xiàn)有感染人的報道[1]，同時也有該寄生蟲感染非特異性宿主的報道，從而間接增加人的感染[2]。在我國的青海、新疆、甘肅、寧夏及四川等地區(qū)，人泡型棘球蚴病又稱“蟲癌”，嚴重威脅著廣大牧民的生命和健康[3]。然而目前對于泡型棘球蚴病的治療以手術(shù)治療為主，藥物治療為輔，但在術(shù)后易出現(xiàn)疾病的復(fù)發(fā)現(xiàn)象，效果欠佳。其防治主要是給犬定期驅(qū)蟲和宣傳教育為主的綜合防治措施，在偏遠地區(qū)該防治措施的效果也不甚理想。因此當(dāng)務(wù)之急應(yīng)積極尋找新的有效防治措施來預(yù)防和控制該病的流行和進一步蔓延。

免疫預(yù)防是防止各種疾病流行方法中比較有效的措施，泡型棘球蚴病也不例外。目前，多房棘球絳蟲相關(guān)抗原分子主要有EMⅡ/3、EM10、EM14-3-3、EM18、EMY162，然而當(dāng)前研究結(jié)果表明，這些抗原分子的保護力較低或不具備其堅強保護力[4-7]。因此需要進一步研究新型的多房棘球絳蟲抗原分子作為候選疫苗分子。EG95分子是一種分子量為24.5 ku的天然抗原[8]，在細粒棘球絳蟲的各個階段均有表達，是針對各階段均具有有效保護作用的疫苗分子[9]。EG95重組抗原、合成肽疫苗、DNA疫苗、重組酵母、重組牛痘病毒疫苗、重組BCG疫苗等的實驗結(jié)果均表明EG95抗原對細粒棘球絳蟲感染宿主具有很好的保護效果，是目前最有效的抗細粒棘球絳蟲的疫苗分子之一[10]。EM95基因最早由Gauci 克隆和鑒定的，其全長2 34 bp，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，其結(jié)構(gòu)與EG95基因相似[11-12]。對其核苷酸和氨基酸序列的進一步分析表明，EM95是一種胞外型和分泌型蛋白，是成為疫苗分子的先決有效條件[11]。EM95免疫小鼠后期保護性可達到78.5%～82.9%，但低于EG95對綿羊的保護率[11，13-14]。因此，本文利用生物信息軟件從生物信息學(xué)方面對EM95B細胞抗原表位進行分析，并與EG95蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)進行比對，為制備更為有效的EM95疫苗的相關(guān)實驗研究奠定理論基礎(chǔ)和提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology， NCBI)數(shù)據(jù)庫中檢索EM95蛋白序列，確定要分析的EM95蛋白序列(登錄號：AAL51153)和EG95蛋白序列(登錄號：AAQ93497)。

1.2生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件 利用常見生物信息學(xué)分析網(wǎng)站和本地分析軟件(見表1)對EM95蛋白的二級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域以及B細胞抗原表位等進行綜合分析與預(yù)測，同時比對了EM95和EG95兩個蛋白一級序列并分析了差異位點存在的區(qū)域。

2 結(jié) 果

EM95蛋白質(zhì)序列由Gauci等提交，其序列來源于從德國普通小鼠中發(fā)現(xiàn)的原頭節(jié)所提取的mRNA所翻譯的蛋白質(zhì)。由156個氨基酸殘基組成，屬分泌蛋白，含有一個糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定點和一個Fn-3型結(jié)構(gòu)域及N∕C端疏水區(qū)[15]。此外有此結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)還有EG95、To45W、TSOL16、TSOL18等[16]。其中Fn-3型結(jié)構(gòu)域是六鉤蚴與中間宿主免疫內(nèi)分泌間相互作用的重要區(qū)域，在誘導(dǎo)免疫保護方面起到重要作用。

2.1EM95和EG95氨基酸殘基比對及差異位點分析 利用EBI網(wǎng)站中的ClustalW2軟件對EM95和EG95氨基酸殘基進行比對(見圖1)，并統(tǒng)計差異位點的氨基酸殘基(見表2)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，EM95和EG95蛋白156個氨基酸殘基中存在31個突變位點，差異達22.2%，其中極性氨基酸殘基突變?yōu)榉菢O性的有3個位點，非極性氨基酸殘基突變?yōu)闃O性的有4個位點，其余均為極性與極性、非極性與非極性間突變。

表1 常用生物信息學(xué)網(wǎng)站及軟件

圖1利用ClustalW2軟件對EM95和EG95蛋白氨基酸殘基比對

Fig.1AminoacidresiduealignmentofEM95andEG95proteinusingClustalW2

表2 EM95和EG95蛋白氨基酸殘基差異位點分析

注：數(shù)字表示序列比對差異位點；+∕-分別表示氨基酸殘基極性內(nèi)與極性間的變異

Note: Numbers indicated the alignment different position; +∕- represents the amino acid residue divergence of intra- and inter-polarity.

2.2EM95抗原B表位分析

2.2.1EM95抗原蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用EXPASY服務(wù)器中SOPMA在線軟件對EM95二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，EM95蛋白質(zhì)中柔性結(jié)構(gòu)占氨基酸殘基總數(shù)的45.51%，其中無規(guī)卷曲占39.10%，β轉(zhuǎn)角占6.41%；α螺旋和β折疊(extended strand)分別占25.64%和28.85%，各種結(jié)構(gòu)在EM95抗原中分布情況(見圖2)。

2.2.2EM95蛋白跨膜區(qū)預(yù)測 使用TMHMM對EM95蛋白進行跨膜區(qū)預(yù)測，TMHMM綜合了跨膜區(qū)疏水性、電荷偏倚、螺旋長度和膜蛋白拓撲學(xué)限制等性質(zhì)，采用隱馬氏模型，對跨膜區(qū)及膜內(nèi)外區(qū)進行整體的預(yù)測(見圖3)。從預(yù)測結(jié)果可以看出EM95蛋白存在一個跨膜區(qū)，其中1～132位氨基酸殘基位于細胞外，139～155位氨基酸殘基跨膜，156位氨基酸殘基位于細胞內(nèi)。這與EM95蛋白C端是疏水區(qū)相吻合。

圖2SOPMA分析的EM95二級結(jié)構(gòu)

Fig.2ThesecondarystructureofEM95usingSOPMAanalysis

圖3 EM95蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測

Fig.3ThetransmembranestructurepredictionofEM95protein

2.2.3DNAStar軟件分析EM95蛋白 DNAStar軟件對EM95蛋白的預(yù)測(見圖4)，Kyte-Doolittle方法預(yù)測EM95親水性區(qū)域為：15～37、47～64、69～87、94～101和105～134。Eisenberg方法預(yù)測的兩親性結(jié)果在親水區(qū)域范圍內(nèi)，與Kyte-Doolittle方法相吻合。Karplus-Schulz預(yù)測EM95柔性區(qū)域顯示可塑性較強的區(qū)域為：18～35,41～47,57～64,69～75,78～82,85～88,93～97,108～122,125～138；采用Jameson-Wolf方法預(yù)測EM95蛋白抗原性發(fā)現(xiàn)存在5個高度的抗原區(qū)，分別位于17～35,57～64,67～89,92～98,105～131。表面區(qū)域通常是良好的抗原，在抗體產(chǎn)生上會有更好的效果，Emni方法表明，EM95蛋白在17～20,27～34,76～82,109～114,126～131等部位氨基酸殘基存在突出表面區(qū)。綜合以上數(shù)據(jù)可推測出EM95蛋白存在5個B細胞抗原表位，分別為:17～35,47～64,69～89,92～98,105～131。

2.2.4在線網(wǎng)站IEBD預(yù)測EM95蛋白抗原B細胞表位 利用在線網(wǎng)站IEBD預(yù)測EM95蛋白抗原細胞表位(見圖5)：1)Chou﹠Fasman Beta-Turn Prediction分值較高區(qū)域為(18～24、28～35、41～49、51～65、68～77、83～90、93～100、108～113、127～129、132～139)；2)對EM95進行Emini表面可及性分析，(分值較高區(qū)域：17～20、27～36、69～72、75～83、94～95、107～121、126～130)；3)Karplus﹠Schulzz柔韌性區(qū)域預(yù)測，EM95分值高的區(qū)域為：18～35、42～47、57～64、69～75、78～82、85～88、93～98、108～122、125～139；4)Kolaskar ﹠ Tongaonkar 抗原性指數(shù)預(yù)測，可能存在的表位區(qū)域為：4～18、33～48、50～59、65～79、86～94、96～107、137～152；5)Parker的親水性預(yù)測顯示EM95的高親水性區(qū)域為：18～33、45～47、59～65、68～73、75～76、79～89、103～116、118～121、124～139；6)Bepipred抗原表位預(yù)測，EM95存在多個Bepipred線性抗原表位區(qū)域為：19～21、25～33、59、61、69～77、81～86、107～111、127～134、137～138。綜合以上參數(shù)分析，得出EM95蛋白可能存在7個潛在B細胞抗原表位區(qū)域：18～35,41～48,50～65,69～90,93～100,107～121,124～139。

圖4 DNAStar軟件分析EM95蛋白各項參數(shù)

綜合以上兩個B細胞抗原表位預(yù)測分析軟件結(jié)果，最終確定EM95抗原B細胞表位有6個可能區(qū)域，分別為：17～35、42～64、69～90、92～100、105～121、124～139。

3 討 論

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，計算機輔助疫苗設(shè)計技術(shù)正帶動著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)向一個新領(lǐng)域飛速發(fā)展。目前在線或本地蛋白質(zhì)分析工具為科研工作者分析蛋白質(zhì)序列，尋找蛋白質(zhì)序列中的特殊結(jié)構(gòu)，進而對其進行加工和修飾，從而使其獲得免疫原性更強的抗原。自上世紀(jì)80年代Hoop和Woods提出親水性參數(shù)預(yù)測抗原表位方法以來[17]，已有許多參數(shù)、算法發(fā)表，在B細胞蛋白抗原表位預(yù)測研究中起到了巨大的推動作用。Hoop-Woods方案認為蛋白質(zhì)氨基酸殘基可分為親水性和疏水性殘基兩類，該方案是以氨基酸殘基由有機相到水相環(huán)境轉(zhuǎn)移的自由能為依據(jù)來計算氨基酸的親水性，親水性殘基一般位于蛋白質(zhì)表面，而疏水性殘基則位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，位于蛋白質(zhì)表面的親水性氨基酸殘基易于B細胞膜上的的受體(BCR)結(jié)合，進而刺激B細胞活化產(chǎn)生抗體。Emini表面可及性分析方案放映了抗原內(nèi)、外兩層氨基酸殘基的分布情況[18]，最早在分析甲型肝炎病毒(HAV)和脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒VP1蛋白表面特征時，合成一段含有HAV特異性氨基酸序列能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HAV中和抗體的合成肽，發(fā)現(xiàn)這兩個病毒蛋白質(zhì)間存在結(jié)構(gòu)同源特征[19]。Karplus和Schulzz柔韌性區(qū)域預(yù)測是基于已知結(jié)構(gòu)的31個蛋白質(zhì)的Cx的溫度β因子，認為蛋白質(zhì)抗原多肽鏈骨架具有一定的活動性，其活動性強的區(qū)域易成為抗原表位來預(yù)測蛋白質(zhì)抗原表位的方法[20]。Kolaskar和Tongaonkar 抗原性指數(shù)預(yù)測方案依據(jù)氨基酸殘基理化特征及在已知表位片段上出現(xiàn)的頻率而發(fā)展起來的預(yù)測蛋白質(zhì)抗原決定簇的方法，其預(yù)測率達75%[21]；Jameson-Wolf抗原指數(shù)預(yù)測方案則是通過對20個研究深入的蛋白質(zhì)中的69個連續(xù)位點上606個氨基酸殘基統(tǒng)計分析而建立起來抗原性刻度[22]。Parker親水性指數(shù)預(yù)測依據(jù)20個合成肽模型保留時間的高效液相層析參數(shù)，同時比較了其他9個相同尺度范圍的參數(shù)，結(jié)果表明，該參數(shù)與抗原性吻合度最好，同時結(jié)合其他三個預(yù)測抗原性較好的參數(shù)來提高預(yù)測的準(zhǔn)確度[23]。Bepipred線性抗原表位預(yù)測方案是在最好的預(yù)測線性B細胞表位的隱馬爾科夫模型的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的抗原表位預(yù)測方法，其預(yù)測效果較其他方法都佳[24]。此外，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方案認為β轉(zhuǎn)角多為位于蛋白質(zhì)抗原表面的凸出結(jié)構(gòu)，易與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，而α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)則不易與抗體嵌合，因此β轉(zhuǎn)角區(qū)域可能為抗原表位[25]。由于各個分析軟件依據(jù)的參數(shù)及模型不一樣，因此只有綜合各個預(yù)測結(jié)果才能提高抗原表位預(yù)測的準(zhǔn)確度。

圖5IEDB分析EM95的B細胞抗原表位

a: Chou ﹠Fasman β轉(zhuǎn)角預(yù)測；b: Emini 表面可及性預(yù)測；c: Karplus ﹠Schulzz柔韌性區(qū)域預(yù)測；d: Kolaskar ﹠ Tongaonkar 抗原性指數(shù)預(yù)測；e: Parker的親水性指數(shù)預(yù)測；f：Bepipred線性抗原表位預(yù)測

Fig.5TheparametersofEM95usingIEDBanalysis

a: Chou ﹠ Fasman Beta-Turn Prediction；b: Emini Surface Accessibility Prediction； c: Karplus ﹠ Schulzz Flexibility Prediction； d: Kolaskar ﹠ Tongaonkar Antigenicity Prediction； e: Parker Hydrophilicity Prediction； f：Bepipred Linear Epitope

EG95蛋白抗原作為免疫疫苗在保護中間宿主中獲得了很好的效果，EG95克隆重組抗原免疫中間宿主(羊)，在六鉤蚴感染實驗中獲得96%～98%免疫保護效果[14]；Larrieu等[26]利用EG95蛋白抗原免疫了3 146只羔羊和311條家犬，同樣獲得了理想的保護效果，并進一步證明EG95蛋白抗原疫苗能保護至3歲齡的動物；同樣EG95蛋白抗原在免疫牛時也取得了理想的免疫效果[27]。而EM95蛋白抗原免疫中間宿主(嚙齒動物)時，獲得的保護率低于EG95蛋白抗原免疫羊所取得的保護率。因此對EM95蛋白和EG95蛋白二級結(jié)構(gòu)及抗原表位分析將有助于找出兩種抗原的差異，為設(shè)計高效的EM95蛋白抗原提供思路。李玉嬌等[8]分析了EG95蛋白抗原的二級結(jié)構(gòu)及抗原表位，最終預(yù)測EG95蛋白可能存在7個潛在B細胞抗原表位，本研究利用了同樣的分析工具，對EM95蛋白進行抗原表位預(yù)測，結(jié)果顯示EM95蛋白可能存在6個抗原表位區(qū)域。同時比對了兩種蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列，發(fā)現(xiàn)在預(yù)測EG95蛋白抗原表位7個區(qū)域中與EM95蛋白相對應(yīng)的位置均存在不同程度的氨基酸殘基替換，其中第1個抗原表位區(qū)域存在2個氨基酸殘基極性間替換(M替換為R、T替換為I)，第3個潛在表位存在1個(S替換為P)，第4個潛在抗原表位存在1個(T替換為A)，第6個潛在抗原表位存在1個(I替換為T)。氨基酸殘基極性間的替換可能對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)造成很大影響，分析EM95蛋白和EG95蛋白潛在抗原表位區(qū)域氨基酸的殘基差異將有助于闡釋EM95蛋白抗原保護力低于EG95蛋白的原因，為開發(fā)理想的EM95蛋白抗原疫苗奠定理論依據(jù)和提供指導(dǎo)。

4 小 結(jié)

本研究利用生物信息學(xué)工具對EM95蛋白的二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)以及B細胞抗原表位進行了綜合預(yù)測，同時分析了EM95和EG95蛋白間的差異，為研發(fā)具有高效保護率的EM95蛋白抗原疫苗提供理論基礎(chǔ)及預(yù)防泡型包蟲病的流行奠定實驗基礎(chǔ)。

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