萬 健，吳三橋，趙冠杰，陳 琛

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs) 是生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，具有抵抗外界微生物侵害的作用，是生物天然免疫系統(tǒng)中的一個重要組成部分，與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定好、水溶性好、強堿性、廣譜抗菌和作用機制獨特等特點[1-4]。20世紀80年代瑞典科學家HG.Boman等從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離出第一個抗菌肽—天蠶素(cecropin)[5]。此后，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發(fā)現(xiàn)了2000多種抗菌肽。抗菌肽可以根據(jù)以上來源分類，也可以根據(jù)結(jié)構(gòu)將其分為5種：(1)α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽，如Cecropin A、Magainin；(2)β-折疊肽，如Tachyplesins；(3)富含半胱氨酸的抗菌肽，如HNP-1，-2和-3；(4) 富含特殊氨基酸的抗菌肽，該類型抗菌肽通常帶有一個或多個占主導地位的氨基酸， 如從牛的嗜中性細胞里分離出來的Indolicidin 由13個氨基酸殘基組成， 其中就含有5個色氨酸；(5)含稀有被修飾氨基酸的抗菌肽。人抗菌肽分為三類：防御素(defensins)、cathelicidins和富組蛋白(histatins)。

防御素是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類具有抵抗外界微生物侵襲的堿性陽離子抗菌肽。人防御素根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)及所含3對二硫鍵連接方式的不同可分為α-防御素(human α-defensin, or human defensin neutrophil peptide,HNP )和β-防御素。α-防御素的3對二硫鍵以1-6，2-4，3-5的方式連接，β-防御素的3對二硫鍵以1-5，2-4，3-6的方式連接(如表1)，它們具有相似的3條反向平行β-片層結(jié)構(gòu)。Bensch等[6]于1995年首次從腎功能衰竭病人的血液透析液中分離出HBD-1并獲得其氨基酸序列，隨后其他5個 HBD被相繼發(fā)現(xiàn)，目前人β-防御素家族有6個主要成員，HBD-1～6。β-防御素主要表達于哺乳動物皮膚和粘膜上皮細胞，是機體抵御外界微生物侵害和參與免疫應答的重要成員，具有極強的抗菌[7]、抗病毒[8-9]、抗腫瘤活性[10]以及免疫學活性[11-13]。本文對HBD的結(jié)構(gòu)、表達部位，原核、真核表達的系統(tǒng)，表達技術(shù)和方法進行了綜述，以期對人β-防御素及其他抗菌肽的基因工程重組表達提供思路。

1 HBD的結(jié)構(gòu)及表達部位

HBD基因定位于人染色體8p22～p23.1區(qū)小于1M的范圍內(nèi)，由2個外顯子和1個內(nèi)含子構(gòu)成，HBD家族的六個主要成員均位于該區(qū)域內(nèi)。HBD前體由93～95個氨基酸組成，包括信號肽、原片段和成熟肽3部分。在整個氨基酸序列中有2種高度保留的氨基酸，一種是位于N端的甘氨酸(2個)，另一種是半胱氨酸(6個)，保守的6個半胱氨酸殘基配對形成3對二硫鍵，起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。二硫鍵和β-片層結(jié)構(gòu)可以使小分子防御素緊密連結(jié)以抵抗蛋白酶水解，即使在富含蛋白的吞噬溶酶體環(huán)境中仍能保持其活性，這也是防御素不同于其他抗微生物肽的主要原因。

HBD-1由36個氨基酸組成，約7.0 kb，其第一個外顯子編碼信號肽和原片段，第二個外顯子編碼成熟肽，在上皮細胞中是生理性表達。HBD-2由41個氨基酸組成，其中第一個外顯子編碼5′端非翻譯區(qū)信號肽區(qū)和前導肽區(qū)，第二個外顯子編碼部分前導肽成熟肽和3′端非翻譯區(qū)，HBD-2的各種生物活性都是由成熟肽來執(zhí)行完成。HBD-2主要表達在受感染刺激后的皮膚和黏膜組織中，是一種誘導型防御素，在感染、炎癥等狀態(tài)下表達明顯增強[14]，且研究人員發(fā)現(xiàn)NF-kB與這種誘導表達密切相關(guān)[15-16]。HBD-3主要表達于皮膚、口腔粘膜和扁桃體中，在呼吸道、生殖道上皮細胞和胎盤中亦有表達，可被TNF-a、IL-1β-、TGF、γ-干擾素等誘導表達。與HBD-1表達方式不同，HBD-2和HBD-3主要為誘導型表達。HBD-4在睪丸中高表達，在胃竇中也有較高表達，而在甲狀腺、肺、腎、子官和中性粒細胞中微表達。HBD-5和HBD-6僅在附睪細胞中有所表達。

表1 人β-防御素氨基酸序列、分子結(jié)構(gòu)

2 HBD的基因工程重組及表達

由于抗生素的長期廣泛使用，使得許多細菌都產(chǎn)生了耐藥性，比較突出的有2010年新德里“超級細菌”事件[17]。與傳統(tǒng)抗菌藥物相比，人β-防御素熱穩(wěn)定性好，高效廣譜抗菌，具有極強的抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫學活性[18]，病原菌對其不易產(chǎn)生耐藥性。HBD的這些優(yōu)點決定其在醫(yī)藥衛(wèi)生、畜牧業(yè)、食品工業(yè)等方面將發(fā)揮極為重要的作用。怎樣大量獲得HBD就成了首要問題，目前獲取的主要途徑有3條：從細胞或體液中提取、化學合成、基因工程表達。HBD在組織中的表達量極少，純化工藝的難度與成本也較高，化學合成價格昂貴，且體內(nèi)蛋白質(zhì)往往需要翻譯后的修飾才具有活性。因此，通過基因工程手段大量生產(chǎn)HBD成為一條非常有效的途徑。

2.1HBD的原核表達 在各種表達系統(tǒng)中，原核表達系統(tǒng)是最早采用的，也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)。大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可高表達外源基因等優(yōu)點，是目前HBD表達采用最多的表達系統(tǒng)。

由于人β-防御素是一類陽離子小分子多肽，表達過程中極易在蛋白酶的作用下降解，而且對宿主細胞有細胞毒性作用，易造成宿主細胞的死亡。通常HBD基因在大腸桿菌中采用融合型表達，即目的蛋白HBD與一段融合標簽序列如組氨酸標簽蛋白(His-Tag)、硫氧化還原蛋白 (Thioredoxin, Trx)、類彈性蛋白(Elastin-like peptide, ELP)、小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-related modifier, SUMO)等融合表達，這些融合標簽可增加HBD mRNA的穩(wěn)定性，為進一步的蛋白分離、純化、檢測等提供便利，同時也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性，其作用類似于天然抗菌肽產(chǎn)生過程中能夠保護抗菌肽及宿主菌的前導肽部分[19]。HBD在大腸桿菌中的表達，國內(nèi)外開展了大量的研究，具體見表2。

表2 人β-防御素在大腸桿菌中的表達

注：DHFR=運載蛋白 Intein=內(nèi)含肽 ND= Not Determined

自Harder等[20]在原核細胞中采用了融合表達的方式，首次實現(xiàn)了HBD-3的體外表達以來，隨著對基因表達調(diào)控機制的深入研究，及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，原核表達系統(tǒng)在功能上得到了進一步的改善，HBD的原核表達經(jīng)歷了一個從無到有，表達量由低到高，抗菌活性由弱到強，純化過程由復雜到簡便的歷程。

雖然HBD在大腸桿菌中表達有諸多優(yōu)點，但大腸桿菌表達體系與其他體系相比也有一些缺點：高效表達但易形成包涵體，不能進行翻譯后的加工修飾，如糖基化、磷酸化、酰基化以及二硫鍵的形成等，而且E.coli表達的蛋白還會保留它們氨基末端的甲硫氨酸，這會影響到目的蛋白的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生免疫原性。最近有研究發(fā)現(xiàn)共表達折疊酶或者分子伴侶在一定程度上能克服包涵體的形成，分子伴侶本身不是功能蛋白的組成部分，但是能夠阻止分子間和分子內(nèi)不正確的折疊，進而幫助蛋白質(zhì)折疊成正確的構(gòu)象。Li等[25]利用小分子泛素蛋白(SUMO)融合表達系統(tǒng)，在大腸桿菌中表達HBD4-SUMO融合蛋白，可以促進HBD4的正確折疊，增加表達量，而且融合蛋白經(jīng)過SUMO酶酶切去除SUMO標簽后，N端沒有殘留氨基酸，得到純度較高的目的蛋白。

最近幾年，研究人員重點研究將目的蛋白與一些具有活性的小蛋白融合，進而促進目的蛋白在E.coil中的表達[27]，或者通過改造現(xiàn)有的表達載體，構(gòu)建各種促溶標簽載體，進而使在E.coli中以包涵體形式表達的蛋白以可溶性形式表達[28]。

2.2HBD的真核表達 真核表達系統(tǒng)包括酵母表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)等。酵母是一類低等真核生物，它既有類似原核生物的生長特性，又有一般真核生物基因表達調(diào)控機制及對表達產(chǎn)物的加工修飾和分泌能力，并且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，是目前HBD表達應用最為普遍的真核表達系統(tǒng)之一。

2.2.1在酵母中表達 酵母表達系統(tǒng)中以畢赤酵母表達系統(tǒng)最為人熟知，具有操作簡單、高水平分泌表達外源蛋白、便于純化、利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。畢赤酵母可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長，而且甲醇能夠誘導畢赤酵母合成大量的乙醇氧化酶(AOX1)。AOX1是強啟動子，能夠高水平誘導表達外源基因。酵母帶有α分泌信號，可引導外源蛋白的分泌，減輕宿主細胞的代謝負荷以及宿主細胞蛋白水解酶的降解作用。近年來研究者開展了HBD在酵母中的表達，具體見表3。

表3 人β-防御素在酵母中的表達

雖然HBD在畢赤酵母中表達相對于在大腸桿菌表達起步比較晚，但畢赤酵母表達系統(tǒng)具有其他表達系統(tǒng)所無法比擬的優(yōu)點: 如對營養(yǎng)要求低，易于高密度發(fā)酵，自身分泌的背景蛋白少，因酵母是真核生物，安全性高，提供翻譯后加工和分泌的環(huán)境，不會形成包涵體，易于進行分離提純等，使得人β-防御素在畢赤酵母中表達的研究有很大的優(yōu)勢。

盡管如此，HBD在畢赤酵母中表達也存在著一些問題，比如畢赤酵母的糖基化程度比哺乳動物偏大，而且糖基化途徑與人不同，從而影響了HBD蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。過去的20多年里，有很多研究人員致力于畢赤酵母的N-糖基化改造過程中。王越等[34]成功構(gòu)建了敲除α-1, 6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因的巴斯德畢赤酵母，和野生型相比，大大降低了蛋白質(zhì)的糖基化程度，從而為酵母的糖基化工程提供了基礎(chǔ)。另外，信號肽加工不完全以及內(nèi)部降解等造成表達產(chǎn)物不均一，這在一定程度上限制了畢赤酵母的應用。酵母表面展示技術(shù)，利用酵母細胞壁蛋白(α-凝集素)與外源蛋白相融合，融合蛋白表達分泌中由于其糖基化蛋白與細胞壁的共價結(jié)合作用，將外源蛋白錨定在細胞壁上[35]。提示，也許以后HBD的表達也能應用這項技術(shù)，這樣可以減少純化工藝，提高回收率。

2.2.2在哺乳動物細胞中表達 HBD在哺乳動物細胞中表達也有報道，彭巍等[36]將HBD-3 cDNA插入到真核表達載體pEGFP-C1 中，構(gòu)建乳腺特異性表達載體pEBCD，脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染奶牛胎兒成纖維細胞G418，之后檢測到重組HBD-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮細胞組織特異性表達。王慧等[37]構(gòu)建HBD-2真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-zeo(+)-HBD-2，經(jīng)脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染293細胞，RT-PCR檢測到HBD-2基因成功轉(zhuǎn)染293細胞，表達的HBD-2有較強的抗金黃色葡萄球菌活性。曹玉紅等分別將重組真核表達載體pcDNA3.1+/HBD4和pEGFP-N2/HBD4導入COS-7和HEK293細胞，均檢測到了HBD4蛋白的表達，并具有較強的殺菌作用[38-39]。

與其它真核細胞表達系統(tǒng)相比，HBD目的基因在哺乳動物細胞中表達與天然的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎完全相同，并且在蛋白合成起始信號、加工、分泌等方面具有獨特優(yōu)勢。但是哺乳動物表達系統(tǒng)成本相對較高，技術(shù)復雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染[40]。

3 展 望

人β-防御素因具有廣譜的抗菌活性，在抵御病原微生物的侵襲、參與免疫反應中發(fā)揮著重要的作用，且病原菌對其不易產(chǎn)生耐藥性，因此它們有望成為一類新型的抗菌藥物，從而解決細菌的耐藥性和抗菌素的毒副作用等問題。通過基因工程技術(shù)制備HBD的研究，將會為今后制備類似藥物奠定基礎(chǔ)，指導抗微生物肽類藥物設(shè)計和開發(fā)，為其提供理想的分子設(shè)計骨架和模板。新型、高效、低毒、廣譜的HBD將會在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、食品、飼料添加劑、動植物抗病轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域發(fā)揮出重要的作用，對人類的健康和生活產(chǎn)生深遠的影響。

表4 各種表達系統(tǒng)比較

表4對HBD基因工程重組表達系統(tǒng)進行了比較，HBD在大腸桿菌中雖能高效表達但易形成包涵體，且后期分離純化過程比較繁瑣，表達后還需要活化才有生物活性；哺乳動物表達系統(tǒng)成本相對較高，技術(shù)復雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染；畢赤酵母表達系統(tǒng)因操作簡單、高水平分泌表達外源蛋白、便于純化、利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，表達產(chǎn)物HBD有較好的抑菌活性等優(yōu)點。隨著對基因表達調(diào)控機制的深入研究及其在生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，所有的表達系統(tǒng)都可以在功能上有進一步的改善。但是，一些表達系統(tǒng)本身固有的缺陷也不能忽略，因此在選擇HBD表達系統(tǒng)時應綜合考慮表達水平、表達周期、安全性、蛋白質(zhì)性質(zhì)等因素。

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