王正，張霽，唐丹舟，王彥斌，侯一平

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)遺傳學(xué)教研室，四川成都610041；2.中國合格評定國家認(rèn)可中心，北京100062）

microRNA（miRNA）是一類長度為18~25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[1-2]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，miRNA基因主要由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA，經(jīng)過兩次剪切生成成熟的miRNA[1-3]。第一次剪切發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，在RNaseⅢDrosha的作用下，pri-miRNA被剪切成70bp左右并具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（premiRNA），再經(jīng)Ran-GTP依賴性核漿轉(zhuǎn)運(yùn)子Exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，在RNaseⅢDicer作用下被剪切成22bp左右的miRNA/miRNA*二聚體。成熟的miRNA整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）并通過識(shí)別靶mRNA發(fā)揮生物學(xué)功能。miRNA與mRNA結(jié)合的互補(bǔ)程度決定miRNA的作用，幾乎完全互補(bǔ)時(shí)引起類似RNA干擾（RNAi）的剪切作用，互補(bǔ)程度較低時(shí)則導(dǎo)致翻譯抑制作用[1-3]。人類基因組中只占1%的miRNA卻調(diào)控著1/3的基因表達(dá)[4]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等生理過程，以及腫瘤發(fā)生發(fā)展、心臟病、糖尿病等病理過程[5-7]。研究[8-10]表明，miRNA的表達(dá)具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性?；趍iRNA的生物學(xué)功能和表達(dá)特點(diǎn)，其在法醫(yī)學(xué)體液鑒定、種屬鑒定和死亡時(shí)間推斷等方面具有潛在的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。本文就miRNA的檢測方法及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行綜述。

1 miRNA的檢測方法

成熟miRNA片段短、GC含量差別大、缺乏共同的序列特征、序列同時(shí)存在于pri-miRNA和premiRNA中，同一個(gè)家族的miRNA只有個(gè)別堿基的差別，這些對miRNA的檢測方法提出了挑戰(zhàn)[11]。目前，miRNA的檢測方法主要有Northern印跡法、芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

Northern印跡法是檢測miRNA表達(dá)的傳統(tǒng)方法，克隆和生物信息學(xué)分析得來的miRNA需經(jīng)Northern印跡法驗(yàn)證和確認(rèn)。這種方法靈敏度較低，對樣本的需求量較高，要微克級樣品才能避免假陰性，且不能進(jìn)行高通量的檢測[12]。

芯片技術(shù)是一種高通量研究miRNA表達(dá)的方法，可以短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測大量miRNA的表達(dá)豐度，是目前檢測整個(gè)基因組內(nèi)組織特異性miRNA表達(dá)豐度最有效的手段。這種方法信息量大卻質(zhì)量低，常伴隨假陽性結(jié)果，且基于不同技術(shù)原理的芯片檢測效果不佳，一般用于前期篩選[13]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號積累實(shí)時(shí)檢測PCR進(jìn)程，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量分析。該方法可以靈敏地定量檢測低豐度表達(dá)的靶分子，并適用于高通量篩選，是目前檢測miRNA表達(dá)最常用的技術(shù)[13-14]。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miRNA

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能高靈敏地檢測低豐度的靶分子，特別是組織標(biāo)本量有限、基因表達(dá)量低以及樣品間表達(dá)差異很小的情況。但在具體實(shí)驗(yàn)中采用不同的檢測技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法可能得到不一致的結(jié)論。要獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)的結(jié)果，RNA提取、cDNA合成、引物設(shè)計(jì)、qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測和數(shù)據(jù)分析這5個(gè)方面至關(guān)重要[11]。

2.1 RNA提取

從樣本中分離出高質(zhì)量、低分子量的RNA組分是miRNA檢測的前提?，F(xiàn)行的RNA提取純化方法主要包括有機(jī)溶劑抽提加乙醇沉淀法[15]和硅膠膜離心柱法[16-17]。前者雖能較好地保留小分子RNA，但后續(xù)的脫鹽和沉淀步驟比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力；后者通常只能富集較大分子的RNA（＞200 nt），小分子RNA往往被漏掉，因而不適用于小分子RNA的分離純化。目前，商品化的試劑盒如mirVanaTMmiRNA Isolation試劑盒（美國Ambion公司）和miRNeasy Mini試劑盒（美國QIAGEN公司）不僅能有效地將包含miRNA的總RNA從樣本中純化出來，還可以進(jìn)一步富集小分子RNA（＜200 nt）來提高靈敏度，且兼?zhèn)潆x心柱快速離心純化的優(yōu)點(diǎn)。要獲得可靠的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，RNA分子完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）一般要大于7[18]。

2.2 cDNA合成

成熟的miRNA片段短、缺乏共同的序列特征，且成熟miRNA的序列也存在于前體中，與mRNA相比，miRNA的逆轉(zhuǎn)錄更為復(fù)雜。目前，miRNA逆轉(zhuǎn)錄的方法主要有兩種，一種是通過特異性引物的3′端與目標(biāo)miRNA結(jié)合直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄引物的5′端結(jié)構(gòu)分莖環(huán)[14]和線性[19]兩種。莖環(huán)逆引物雖然較難設(shè)計(jì)但可以避免逆轉(zhuǎn)錄引物與miRNA的前體或同一家族的miRNA結(jié)合。線性逆引物設(shè)計(jì)簡單，但不能阻止引物和前體序列結(jié)合，也不能有效區(qū)別只有個(gè)別堿基差別的同一家族miRNA。另一種方法是使用通用引物逆轉(zhuǎn)錄樣品中的全部miRNA。通用引物5′端的oligo（dT）序列識(shí)別事先經(jīng)E.coli Poly（A）聚合酶添加至miRNA的3′端，從而將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA[20]。使用特異性引物可以降低背景信號，但起始模板量很少以及需要同時(shí)檢測幾個(gè)miRNA時(shí)，通用引物比較實(shí)用。

2.3 引物設(shè)計(jì)

miRNA的GC含量差異大、互補(bǔ)序列的Tm值不同、同一個(gè)家族的miRNA序列相近等特征，給引物設(shè)計(jì)帶來一定難度。qPCR產(chǎn)物的特異性與引物的設(shè)計(jì)密切相關(guān)，引物的設(shè)計(jì)與逆轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)物檢測方法有關(guān)。如果引物和目標(biāo)序列的預(yù)測Tm值較高（＞65℃），可以通過設(shè)計(jì)較短的引物來增加特異性；如果Tm值較低（＜55℃），往往不能保證引物的特異性。TaqMan?MicroRNA Assay（美國AB公司）是目前檢測miRNA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[14]，其具有在cDNA合成階段通過莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和在qPCR階段通過TaqMan探針雙重保障檢測的特異性。逆轉(zhuǎn)錄引物5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成的堿基堆積和空間限制能顯著增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄的特異性。TaqMan探針的槽溝結(jié)合物結(jié)構(gòu)能在不增加探針長度的情況下提高Tm值，進(jìn)一步保證特異性。

2.4 qPCR產(chǎn)物檢測

qPCR的熒光技術(shù)有很多，如SYBR?GreenⅠ核酸染料、TaqMan?探針、分子信標(biāo)（Molecular beacons）、LUX熒光系統(tǒng)（Light Upon eXtension）和Light-Cycler?HybProbes探針。目前應(yīng)用于miRNA檢測的熒光技術(shù)是SYBR?GreenⅠ[20-21]和TaqMan?探針[14，22-23]。SYBR?GreenⅠ是一種與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料，其與DNA雙鏈的結(jié)合是非特異性的，需進(jìn)行融解曲線分析來確定產(chǎn)物的特異性，且不能復(fù)合檢測多個(gè)目標(biāo)分子。TaqMan?探針是雙標(biāo)記的水解探針，是與特異性產(chǎn)物結(jié)合的短序列，其5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端含有淬滅基團(tuán)，探針完好時(shí)淬滅基團(tuán)吸收報(bào)告基團(tuán)的熒光。當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，Taq酶水解探針，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號，每合成一個(gè)雙鏈就產(chǎn)生一個(gè)熒光信號。TaqMan?探針不受miRNA前體、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾，對于家族miRNA的檢測特異性高，定量檢測的線性范圍跨越7個(gè)數(shù)量級，可以準(zhǔn)確定量擴(kuò)增目標(biāo)[14]。

2.5 數(shù)據(jù)分析

比較樣本間miRNA的表達(dá)豐度需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以消除非生物學(xué)變化對結(jié)果的影響，使用內(nèi)參基因是標(biāo)準(zhǔn)化的常用方法[24]。傳統(tǒng)的內(nèi)參基因并不適用所有的實(shí)驗(yàn)條件，在具體實(shí)驗(yàn)中必須驗(yàn)證內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[24]。Vandesompele等[25]建議使用多個(gè)內(nèi)參基因以提高數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。Mestdagh等[26]報(bào)道使用miRNA平均表達(dá)值歸一法進(jìn)行miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，但此方法比較適用于檢測分析大量的miRNA。最近，Hruz等[27]開發(fā)的RefGenes軟件可從miRNA芯片數(shù)據(jù)中尋找穩(wěn)定表達(dá)的miRNA作為內(nèi)參基因。

如何正確分析數(shù)據(jù)是解釋qPCR結(jié)果生物學(xué)意義的關(guān)鍵。最簡單的方法是ΔΔCt法[28]，此法僅依賴Ct值，沒有考慮擴(kuò)增效率對結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)樣本間存在不同的總RNA組成、逆轉(zhuǎn)錄抑制物和PCR抑制物，擴(kuò)增效率不可能總為100%，而擴(kuò)增效率對相對表達(dá)的計(jì)算影響甚大[29-31]。盡管ΔΔCt法不能準(zhǔn)確估計(jì)相對cDNA的初始量，但此法非常簡單，可以作為初期快速篩選miRNA特異性表達(dá)的方法。相對表達(dá)率模型考慮了目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率對表達(dá)量的影響，分析更為準(zhǔn)確[30-31]，當(dāng)目標(biāo)和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率都為100%時(shí)，此模型本質(zhì)上等同于ΔΔCt法。

準(zhǔn)確定量miRNA的表達(dá)豐度不僅需要高靈敏度和高特異性的檢測方法，而且還需要精確的數(shù)據(jù)分析模型。Wang等[31]采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和TaqMan?探針技術(shù)檢測miRNA的表達(dá)豐度以及使用效率校正模型計(jì)算相對表達(dá)率，提出了一個(gè)適用法醫(yī)學(xué)檢材中miRNA的分析流程。

3 miRNA的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及前景

法醫(yī)工作中鑒定生物斑痕的體液來源對案件性質(zhì)的判定至關(guān)重要?；趥鹘y(tǒng)血清學(xué)和免疫學(xué)的體液鑒定方法靈敏度各異、周期長、需要檢材量大、一次只能驗(yàn)證一種體液、不能確認(rèn)陰道分泌物和月經(jīng)血，并不適用于法醫(yī)實(shí)際工作中常常遇到的微量檢材[32-36]。近年來，檢測組織中特異性表達(dá)的mRNA被提出代替?zhèn)鹘y(tǒng)體液鑒定方法，但熱度、濕度、紫外線、pH值和RNA水解酶（ribonuclease，RNase）對mRNA（擴(kuò)增產(chǎn)物長度200~300 nt）的穩(wěn)定性有很大影響，檢出片段大小有時(shí)間依賴性，并受基因組DNA的影響，不適合法醫(yī)工作中面臨的降解檢材[35-41]。miRNA片段短、不易降解、表達(dá)具有組織特異性或豐度差異性和成熟的檢測技術(shù)使其本質(zhì)上更適合法醫(yī)體液（斑）鑒定。2009年，Hanson等[42]使用SYBR?Green qPCR技術(shù)從452個(gè)人類miRNA中檢測出9個(gè)具有體液差異性表達(dá)的miRNA（表1）；同時(shí)檢測體液標(biāo)記miRNA在人類21種組織中的表達(dá)水平，確保標(biāo)記miRNA的體液特異性，從而將miRNA引入到法醫(yī)學(xué)體液鑒定中。2010年，Zubakov等[43]采用寡核苷酸芯片檢測718個(gè)人類miRNA在法醫(yī)常見體液中的表達(dá)水平，并用TaqMan qPCR技術(shù)鑒定出9個(gè)體液標(biāo)記miRNA（表1），但僅能重復(fù)出Hanson等[42]報(bào)道的血液和精液標(biāo)記miRNA，該研究的靈敏度達(dá)到了0.1 pg總RNA，且實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下保存1年的陳舊體液斑痕對檢出也無明顯影響。2011年，Courts等[44]利用Geniom?Biochips檢測人類血液和唾液中miRNA的表達(dá)水平，后續(xù)的SYBR?Green-qPCR確認(rèn)了6個(gè)標(biāo)記miRNA（表1），但并未檢測其他法醫(yī)常見體液。目前報(bào)道的體液標(biāo)記miRNA數(shù)量有限，而且采用不同的檢測平臺(tái)和數(shù)學(xué)分析模型，所報(bào)道的結(jié)果不一致、重復(fù)性差。Wang等[31，45]首先建立了一個(gè)適用法醫(yī)學(xué)檢材miRNA的分析流程；其后利用qPCR-array篩選、TaqMan qPCR驗(yàn)證、效率校正模型分析鑒定出5個(gè)體液標(biāo)記miRNA（表1），并評估了擴(kuò)增效率對檢測結(jié)果的影響和常用內(nèi)參基因在法醫(yī)體液（斑）中的穩(wěn)定性。目前，在人類已發(fā)現(xiàn)的2042個(gè)成熟體miRNA（http://www.mirbase.org），可進(jìn)一步尋找更多的體液標(biāo)記miRNA。對體液標(biāo)記的miRNA一方面可嘗試建立復(fù)合檢測體系，另一方面可結(jié)合DNA和RNA共提取技術(shù)以節(jié)約樣本量，結(jié)合STR分型技術(shù)共平臺(tái)同時(shí)檢測體液（斑）的來源和STR分型。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道體液標(biāo)記的miRNA

現(xiàn)場生物檢材的種屬鑒定可將犯罪嫌疑人與犯罪現(xiàn)場聯(lián)系起來或在涉及動(dòng)物交通事故、偷獵等案件時(shí)發(fā)揮作用。Li等[46]檢測人類血液標(biāo)記miR-16在9種動(dòng)物血中的表達(dá)豐度，嘗試?yán)胢iRNA進(jìn)行種屬鑒定,結(jié)果提示,根據(jù)miR-16的表達(dá)豐度可以將9種動(dòng)物分為2個(gè)亞組。大多數(shù)miRNA基因具有保守性，在脊椎動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)的miRNA中有近一半具有同源性[47]，將miRNA應(yīng)用于種屬來源鑒定需要深入研究篩選種屬特異性miRNA標(biāo)記和豐度差異性同源miRNA標(biāo)記。

李文燦等[48]探討大鼠死后心肌細(xì)胞中miR-1-2和18S rRNA的含量變化與PMI的關(guān)系，旨在為PMI推斷研究提供新的標(biāo)記物，以克服傳統(tǒng)依據(jù)尸體現(xiàn)象、胃內(nèi)容物消化過程、蠅蛆生長規(guī)律等方法的局限性。研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體死后120 h內(nèi)miR-1-2的含量保持在一個(gè)相對穩(wěn)定的水平，死亡早期時(shí)間內(nèi)可以作為一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)參指標(biāo)反映其他生物學(xué)標(biāo)記物的變化水平。在死亡120 h后miR-1-2含量開始下降，提示miRNA可能有時(shí)間依賴降解特性，尚需進(jìn)一步進(jìn)行人體檢材驗(yàn)證和尸體存放環(huán)境溫度和濕度等因素對miRNA的影響。

Hackl等[49]采用miRNA芯片技術(shù)檢測人類細(xì)胞衰老模型和機(jī)體衰老模型中miRNA的表達(dá)豐度，發(fā)現(xiàn)4種衰老調(diào)節(jié)的miRNA：miR-17、miR-19b、miR-20a和miR-106a，其中miR-17最為顯著，表明miRNA可作為人類細(xì)胞衰老的一種新標(biāo)記。Noren Hooten等[50]發(fā)現(xiàn)9個(gè)miRNA（miR-103、miR-107、miR-128、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496和miR-1538）在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)豐度隨年齡增長而下降，進(jìn)一步證實(shí)miRNA的表達(dá)具有隨年齡變化的特征。這些研究提示miRNA的表達(dá)豐度可能具有年齡特異性，可為個(gè)體年齡推斷研究提供一種新思路。

綜上，借助miRNA的生物學(xué)特征和表達(dá)特點(diǎn)，其作為一種新的標(biāo)記有望在法醫(yī)學(xué)體液鑒定、種屬鑒定及PMI推斷等方面提供一條新途徑。

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