王培 魯義善 王蓓 湯菊芬 蔡佳吳灶和簡(jiǎn)紀(jì)常

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

無(wú)乳鏈球菌誘導(dǎo)吉富羅非魚(yú)分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重鏈基因的克隆及原核表達(dá)

王培1，2，3魯義善1，2，3王蓓1，2，3湯菊芬1，2，3蔡佳1，2，3吳灶和2，3，4簡(jiǎn)紀(jì)常1，2，3

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

以滅活的無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）誘導(dǎo)后的吉富羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）為材料，構(gòu)建其頭腎SMART cDNA文庫(kù)，應(yīng)用同源性克隆和RACE-PCR技術(shù)克隆到吉富羅非魚(yú)（O. niloticus）分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重鏈基因的全長(zhǎng)cDNA序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。sIgM基因cDNA全長(zhǎng)為1 921 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 740 bp，5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）41 bp，3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）140 bp，編碼579個(gè)氨基酸，N端有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)分子量（MW）為64.26 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.36。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，吉富羅非魚(yú)（O. niloticus）sIgM與牙鲆（Paralichthys olivaceus）和軍曹魚(yú)（Rachycentron canadum）的親緣關(guān)系較近。sIgM基因有4個(gè)恒定區(qū)。將吉富羅非魚(yú)（O. niloticus）sIgM基因恒定區(qū)序列克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（+）中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28-sIgM，誘導(dǎo)表達(dá)后確定最優(yōu)條件為37℃條件下，IPTG濃度為0.05 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)4 h蛋白表達(dá)量最大。純化蛋白后經(jīng)Western blot分析，sIgM融合蛋白與鼠抗His-Tag發(fā)生特異結(jié)合，表明目的蛋白成功表達(dá)。

吉富羅非魚(yú) 免疫球蛋白M 基因克隆 原核表達(dá) 蛋白免疫印跡

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是免疫系統(tǒng)中重要組成部分。硬骨魚(yú)類中，目前只發(fā)現(xiàn)了IgM、IgD、IgZ/IgT及一個(gè)嵌合體IgM-IgZ［1］，它們?cè)隗w液免疫應(yīng)答中起到最重要的介質(zhì)作用。IgM是硬骨魚(yú)類中最常見(jiàn)的免疫球蛋白分子，大多數(shù)是由四聚體組成，而每個(gè)亞基都包含一對(duì)共價(jià)連接的重輕鏈二聚體［2］。硬骨魚(yú)類的IgM有分泌型（Secretory form of IgM，sIgM）和膜結(jié)合型（Membrance-bound，mIgM）兩種形式，它們的重鏈（IgH）由相同基因編碼，但由于mRNA前體加工過(guò)程決定重鏈基因的合成與表達(dá)形式［3］，因此，這兩種形式的IgM恒定區(qū)也不完全相同，在分泌型IgM中存在4個(gè)恒定區(qū)，而在膜結(jié)合型IgM分子中則只有3個(gè)恒定區(qū)和一個(gè)位于CH3下游的跨膜結(jié)構(gòu)（Transmembrane domain，TM）［4］。sIgM由血漿細(xì)胞產(chǎn)生并分泌于體液中，而mIgM分子則存在于B細(xì)胞質(zhì)膜表面，作為特異性抗原結(jié)合受體［5，6］。前者是機(jī)體進(jìn)行體液免疫中的重要組成部分，在研究魚(yú)類病害防治及免疫預(yù)防方面具有重要意義。

吉富羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）是世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類，通常生活于淡水中，也能生活于不同鹽分含量的咸水中，具有較高的食用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但近年來(lái)飽受鏈球菌病的困擾，其中無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是引起養(yǎng)殖魚(yú)類爆發(fā)鏈球菌病的主要病原之一，深入探討無(wú)乳鏈球菌誘導(dǎo)后宿主免疫分子的波動(dòng)規(guī)律，對(duì)鏈球菌疫苗的評(píng)價(jià)尤為重要。本研究擬從免疫球蛋白入手，對(duì)經(jīng)滅活無(wú)乳鏈球菌誘導(dǎo)后，吉富羅非魚(yú)（O. niloticus）分泌型IgM重鏈基因進(jìn)行克隆與分析，并對(duì)其蛋白的原核表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，期望從分子角度為羅非魚(yú)免疫防治及病害控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用吉富羅非魚(yú)（體質(zhì)量約100 g）由廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地提供?？俁NA提取試劑盒是生工生物工程（上海）股份有限公司的產(chǎn)品，RACE所用試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自Clontech公司，pMD-18T vector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，本研究所用的所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 用經(jīng)滅活的無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）ZQ0910株免疫吉富羅非魚(yú)，24 h后取其頭腎，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取羅非魚(yú)總RNA。取2 μL用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit合成cDNA文庫(kù)，-20℃保存。

1.2.2sIgM片段擴(kuò)增 根據(jù)已知的其他魚(yú)類的IgM恒定區(qū)保守序列設(shè)計(jì)兩條簡(jiǎn)并引物MF/MR（表1），以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。將所得的目的片段回收純化并連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，篩選單克隆，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)為陽(yáng)性后測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 RACE擴(kuò)增sIgM全長(zhǎng)序列 根據(jù)得到的sIgM中間片段序列，分別設(shè)計(jì)5'巢式引物5-MSP1、5-MSP2和3'巢式引物3-MSP1和3-MSP2。經(jīng)兩輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增出5'端和3'端片段。首輪反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s，66℃退火60 s，72延伸70 s，運(yùn)行10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降1℃；94℃變性60 s，56℃退火60 s，72℃延伸70 s，運(yùn)行20個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將首輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)條件與首輪反應(yīng)相同。純化回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化、篩選單克隆及測(cè)序。

1.2.4 序列拼接及分析 對(duì)測(cè)序后所得的序列進(jìn)行多種生物信息軟件的分析。首先，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)和相似性分析；再通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，得到sIgM基因的全長(zhǎng)，利用ORF Find在線軟件進(jìn)行ORF的預(yù)測(cè)，使用ExPASy軟件將核酸翻譯成氨基酸序列；在InterProScan Sequence Search網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析，確定sIgM的可變區(qū)和恒定區(qū)；通過(guò)在線分析工具NeTPhos2.0Server和NeTOGlyC3.1Server分別對(duì)羅非魚(yú)sIgM的磷酸化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。SignalP 3.0 Server在線網(wǎng)站進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；通過(guò)在NCBI上搜索IgM恒定區(qū)的同源序列，使用Clustal X2.0軟件對(duì)吉富羅非魚(yú)sIgM恒定區(qū)和其他硬骨魚(yú)類的IgM恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)；采用MEGA4.0軟件完成系統(tǒng)進(jìn)化分析，鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 吉富羅非魚(yú)sIgM基因恒定區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已獲得的sIgM基因cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性sIgM恒定區(qū)表達(dá)引物M-μ-F 和M-μ-R，并在兩條引物的5'端引入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)。通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增sIgM恒定區(qū)序列?；厥铡⑦B接、轉(zhuǎn)化、篩選單克隆，測(cè)序驗(yàn)證。

將測(cè)序正確的菌液抽提質(zhì)粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切該質(zhì)粒和pET-28a（+）質(zhì)粒，用T4連接酶將酶切后的產(chǎn)物連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-sIgM。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)中，涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，篩取單克隆PCR菌落鑒定，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.6 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化 將測(cè)序正確的菌液以1∶100比例接種于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6，加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol/L，于37℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h。取1 mL菌液10 000 r/min離心收集菌體，處理樣品，SDS-PAGE分析。

在37℃和28℃條件下（IPTG濃度為0.2 mmol/ L）誘導(dǎo)4 h，分別離心菌體并超聲破碎，將離心后的上清液和下沉液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；IPTG濃度分別為0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h，處理樣品，SDS-PAGE分析；誘導(dǎo)時(shí)間分別為0.5、1、2、3、4 h，5、6和7 h，37℃，IPTG濃度為0.05 mmol /L，處理樣品，SDSPAGE分析；用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳，丙烯酰胺濃度：分離膠12%（V/V），濃縮膠5%（V/V）。每孔上樣7 μL，濃縮膠以80 V電壓通電30 min，分離膠以120 V電壓通電1 h，染色，脫色。

1.2.7 重組融合蛋白的提取與純化 將按照最優(yōu)表達(dá)條件誘導(dǎo)后的菌液離心后用PBS重懸，于冰上超聲破碎，破碎程序?yàn)楣β?00 W，超聲破碎時(shí)間6 s，間隔8 s，直至菌液澄清。離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。采用HisTrapTMHP親和層析柱純化蛋白，分別用含30、50、75、100、150、200、250和300 mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脫樣品，并分別收集樣品。

1.2.8 Western blot檢驗(yàn) 將純化后的sIgM融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，按常規(guī)方法進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)移。4℃，70 mA轉(zhuǎn)印約150 min。5%脫脂牛奶37℃封閉3 h，加入一抗（鼠抗His單克隆抗體，1∶2 000稀釋）孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；然后，加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶500稀釋）孵育1 h，再用TBST清洗3次，每次10 min；最后加入DAB顯色液，待出現(xiàn)明顯條帶后立即用ddH2O終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 sIgM片段擴(kuò)增結(jié)果

利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約500 bp的一段序列，測(cè)序后在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索，確認(rèn)為sIgM其中一部分序列。

2.2 3'端和5'端RACE

根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物按照試劑盒說(shuō)明分別進(jìn)行3'端和5'端RACE擴(kuò)增，得到與預(yù)期相符合的目的條帶（圖1），測(cè)序后得到的基因片段大小分別為1 280 bp和591 bp。

2.3 羅非魚(yú)sIgM 重鏈基因全長(zhǎng)cDNA序列

將得到的中間片段序列3'RACE和5'RACE序列進(jìn)行拼接，獲得1 921 bp的羅非魚(yú)sIgM全長(zhǎng)序列（GenBank登錄號(hào)：KF305823）。該序列含有一個(gè)能編碼579個(gè)氨基酸的1 740 bp的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF），以及5'末端41 bp的非編碼區(qū)（5'-UTR）和3'末端140 bp的非編碼區(qū)（3'-UTR）。其中3'端非編碼區(qū)包含終止密碼子TAA和一個(gè)polyA加尾信號(hào)：AATAAA。根據(jù)預(yù)測(cè)的氨基酸序列，預(yù)測(cè)羅非魚(yú)sIgM的理論等電點(diǎn)（pI）為5.36，理論分子量為64.26 kD。利用SignalP 3.0 Server網(wǎng)站對(duì)sIgM氨基酸序列進(jìn)行N端信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，1-19氨基酸處為信號(hào)肽。TMHMMOL/L Server v. 2.0軟件預(yù)測(cè)該序列不存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。通過(guò)在線分析工具分別對(duì)羅非魚(yú)sIgM氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列含有30個(gè)磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析，確定sIgM有一個(gè)可變區(qū)（VH）、一個(gè)連接區(qū)段（JH）和4個(gè)恒定區(qū)（CH）。將吉富羅非魚(yú)的sIgM基因恒定區(qū)氨基酸序列與紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、斑馬魚(yú)（Danio rerio）、大馬哈魚(yú)（Oncorhynchus mykiss）、黃尾魚(yú)（Plecoglossus altivelis）、南極巖斑鱈魚(yú)（Notothenia coriiceps）、頭帶冰魚(yú)（Chaenocephalus aceratus）及團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的sIgM恒定區(qū)氨基酸序列進(jìn)行序列相似性對(duì)比（圖2），發(fā)現(xiàn)每個(gè)恒定區(qū)幾乎都含有保守的半胱氨酸和色氨酸。根據(jù)不同魚(yú)類的IgM氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示（圖3），吉富羅非魚(yú)IgM與牙鲆（Paralichthys olivaceus）和軍曹魚(yú)（Rachycentron canadum）親緣關(guān)系較近。

2.4sIgM基因恒定區(qū)的克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)設(shè)計(jì)的羅非魚(yú)sIgM恒定區(qū)引物，得到1 338 bp的恒定區(qū)片段。測(cè)序后證實(shí)為sIgM目的序列。將sIgM基因的目的片段與pMD-18T載體連接，篩選陽(yáng)性克隆，酶切回收片段，目的片段與pET-28a（+）載體連接后轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定及測(cè)序驗(yàn)證pET28-sIgM重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖4）。

2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組質(zhì)粒pET28-sIgM轉(zhuǎn)化入E.coliBL21，經(jīng)誘導(dǎo)條件（37℃，0.5 mmol/L IPTG，4 h，OD6000.4-0.6）誘導(dǎo)后，可以表達(dá)出52.37 kD左右的融合蛋白（圖5），而sIgM恒定區(qū)的蛋白分子量為49.37 kD，標(biāo)簽蛋白pET-28a的分子量約為3 kD。將經(jīng)過(guò)不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒與未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行SDSPAGE分析（圖6）。通過(guò)對(duì)溫度、IPTG濃度、和時(shí)間的優(yōu)化，確定重組質(zhì)粒pET28-sIgM最佳誘導(dǎo)條件為37℃條件下，IPTG濃度為0.05 mmol/L，誘導(dǎo)4 h。從圖6-A中可以看到，細(xì)菌超聲破碎后，重組蛋白主要存在于沉淀中，而在上清液中幾乎不存在。因此，重組融合蛋白主要是以包涵體的形式表達(dá)。

2.6 重組質(zhì)粒的純化及鑒定

在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)pET28-sIgM重組蛋白，收集菌體，提取包涵體，將蛋白樣品用HisTrapTMHP親和層析柱進(jìn)行純化。分別采用不同濃度的咪唑緩沖液洗脫，收集后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，圖7-A顯示在200 mmol/L咪唑濃度條件下洗脫純化效果最好。用K4000 Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定洗脫液的蛋白濃度為490 μg/mL 。Western blot分析（圖7-B）顯示，純化后的sIgM重組融合蛋白可以與His-Tag單克隆抗體結(jié)合，蛋白大小和融合蛋白大小一致，結(jié)合測(cè)序結(jié)果推斷，已成功表達(dá)出吉富羅非魚(yú)sIgM蛋白。

3 討論

在硬骨魚(yú)類已經(jīng)報(bào)道的免疫球蛋白中，IgM作為最重要的一類免疫球蛋白，在魚(yú)類的體液免疫中發(fā)揮著重要的作用。而IgM以兩種形式存在：一是存在于血液和其他體液中的分泌型Ig（sIgM），二是存在于細(xì)胞表面作為抗原結(jié)合受體存在的膜結(jié)合型Ig（mIgM）；區(qū)別這兩種類型的IgM關(guān)鍵在于其重鏈的C端，C端是疏水區(qū)則與細(xì)胞膜結(jié)合形成mIgM，C端為親水區(qū)則形成sIgM。而這兩種形式的Ig分子重鏈基因?qū)嶋H上由同一個(gè)基因編碼，只是其mRNA前處理過(guò)程在兩種形式Ig的分化中具有決定性的作用［7］。事實(shí)上，在哺乳類、鳥(niǎo)類中，mIgM的產(chǎn)生是由TM直接與CH4外顯子中剪切位點(diǎn)相連。而大部分硬骨魚(yú)類，其mIgM的產(chǎn)生主要由跨膜區(qū)直接連接到CH3外顯子的一個(gè)隱蔽的剪切位點(diǎn)，從而形成膜結(jié)合型免疫球蛋白M［5，8］，這種剪切方式已經(jīng)在很多種硬骨魚(yú)中被證實(shí)［9-12］。對(duì)于以CH3-TM剪切方式產(chǎn)生的mIgM來(lái)說(shuō)，由于這種剪切方式直接導(dǎo)致TM與CH3位點(diǎn)連接，從而使CH4被剪切掉，但連接到CH3的跨膜結(jié)構(gòu)的分子量沒(méi)有CH4分子量大，所以此種剪切方式所產(chǎn)生的mIgM重鏈分子量會(huì)明顯小于sIgM的重鏈分子量［13］。而sIgM則是在IgM分子恒定區(qū)羧基端不存在這種剪切方式，但由于在CH4下游缺少一個(gè)附加的分泌域，硬骨魚(yú)類的sIgM整個(gè)恒定區(qū)CH1-CH4一起被認(rèn)為是一個(gè)分泌域［4］，共同決定sIgM的生物功能。因此，真正影響這兩種形式的IgM的產(chǎn)生最主要的原因是其剪切方式的不同，也就是說(shuō)只要弄清楚IgM分子的剪切方式即可判定IgM的分子類型。本研究采用在線分析軟件對(duì)所得到的吉富羅非魚(yú)IgM恒定區(qū)羧基端進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其不含有跨膜結(jié)構(gòu)（TM），而TM是區(qū)分分泌型和膜結(jié)合型兩種IgM分子的重要標(biāo)志。因此，本研究所得的羅非魚(yú)IgM應(yīng)為分泌型IgM。雖然吳鐵軍等［14］早在2009年已經(jīng)對(duì)羅非魚(yú)IgM重鏈基因進(jìn)行克隆，但并沒(méi)有對(duì)羅非魚(yú)物種做出細(xì)化的分析，也沒(méi)對(duì)所得的IgM重鏈基因進(jìn)行分型和基因的編碼形式做出分析。因此，本研究在前人所作研究的基礎(chǔ)上，從吉富羅非魚(yú)頭腎cDNA文庫(kù)中首次擴(kuò)增出sIgM重鏈基因序列，并通過(guò)生物信息學(xué)及分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚(yú)sIgM基因的基本結(jié)構(gòu)形式為L(zhǎng)eader-VH-JH-CH1-CH2-CH3-CH4。

本研究中，將所得到的羅非魚(yú)的sIgM基因序列及所編碼的氨基酸序列與GenBank中其它魚(yú)類IgM基因及氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示吉富羅非魚(yú)sIgM與其它已知物種的sIgM具有較高的同源性。羅非魚(yú)的sIgM基因包含一個(gè)多變區(qū)（VH），一個(gè)連接區(qū)段（JH），4個(gè)典型的恒定區(qū)（CH），幾乎每個(gè)恒定區(qū)都含有一個(gè)與二硫鍵連接的半胱氨酸和一個(gè)穩(wěn)定三級(jí)結(jié)構(gòu)的色氨酸，其位點(diǎn)都相對(duì)保守，其中第一個(gè)恒定區(qū)（CH1）含有兩個(gè)半胱氨酸，而第一個(gè)半胱氨酸具有與IgM輕鏈連接的作用［15］。在sIgM蛋白序列的N端還有一個(gè)由19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，該信號(hào)肽位于分泌蛋白的N末端，可以引導(dǎo)新生肽穿越質(zhì)膜，對(duì)外分泌蛋白的分泌起重要作用［16，17］。

外源蛋白的原核表達(dá)是最快捷、最經(jīng)濟(jì)的獲得目的蛋白的表達(dá)方法，而大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，因此在研究各種蛋白功能時(shí)，原核重組是重要的試驗(yàn)方法［18］。本研究利用含有T7啟動(dòng)子的pET-28a（+）原核表達(dá)載體成功表達(dá)出融合蛋白pET28-sIgM，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，蛋白表達(dá)量有所提高［19］。為了得到更多的目的蛋白，本試驗(yàn)采用單因素法分別從溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度和時(shí)間三方面對(duì)pET28-sIgM重組表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，從而選擇出最優(yōu)誘導(dǎo)條件。由于溫度影響酶反應(yīng)速率，因此在37℃條件下sIgM重組蛋白顯著表達(dá)。IPTG不僅具有誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的功能，還對(duì)菌體代謝產(chǎn)生毒性作用，因此選擇IPTG最低有效濃度，可以降低不必要的代謝產(chǎn)物影響蛋白性質(zhì)［20］。在確定溫度和誘導(dǎo)劑的濃度時(shí)，隨著時(shí)間的加長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量顯著增加，當(dāng)達(dá)到頂峰時(shí)，蛋白表達(dá)量開(kāi)始下降，這表明時(shí)間也是控制蛋白表達(dá)的重要因素。綜上所述，最終確定在37℃條件下，IPTG濃度為0.05 mmol/L誘導(dǎo)4 h時(shí)重組蛋白表達(dá)量最高。在大量成功表達(dá)出融合蛋白sIgM后，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)產(chǎn)物中重組蛋白主要以包涵體的形式存在。而包涵體是由重組蛋白、外膜蛋白、DNA、肽聚糖等雜體組成［21］。由于pET28a（+）表達(dá)載體具有6個(gè)His標(biāo)記，因此通過(guò)HisTrapTMHP親和層析柱進(jìn)行純化，得到高純度的重組融合蛋白。Western blot顯示，sIgM重組蛋白與鼠抗His-Tag發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明成功獲得羅非魚(yú)sIgM重組融合蛋白。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究成功克隆出吉富羅非魚(yú)sIgM重鏈基因序列，其結(jié)構(gòu)、組成以及功能域與其它硬骨魚(yú)類免疫球蛋白家族類似。通過(guò)原核表達(dá)獲得重組蛋白，對(duì)后續(xù)制備多克隆抗體用于羅非魚(yú)免疫機(jī)制的研究提供了重要的依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression of Secretory Form of Immunoglobulin M（sIgM）Heavy Chain Gene in GIFT Strain of Nile Tilapia（Oreochromis niloticus）Induced by Streptococcus agalactiae

Wang Pei1，2，3Lu Yishan1，2，3Wang Bei1，2，3Tang Jufen1，2，3Cai Jia1，2，3Wu Zaohe2，3，4Jian Jichang1，2，3
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Guangdong Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；4 .Zhongkai University of Agriculture and Engineering，GuangZhou 510225）

GIFT strain of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）, induced by inactivated Streptococcus agalactiae, was used to construct the head kidney cDNA library. The full-length sIgM cDNA of Nile Tilapia was cloned using homological cloning and rapid amplification of cDNA ends（RACE）methods. Results showed the full-length of sIgM cDNA was 1 921 bp, containing a 5' untranslated region（5'-UTR）of 41 bp, a 3'-UTR of 140 bp and an open reading frame of 1 740 bp encoding 579 amino acids with an estimated molecular weight of 64.26 kD and an estimated isoelectric point of 5.36. In the N-terminal of sIgM exists a signal peptide structure. The phylogenetic trees constructed showed that sIgM of Nile tilapia shared the closest relationship with the corresponding proteins of Paralichthys olivaceus and Rachycentron canadum. The sIgM had four CH domains. The constant segment of sIgM gene was amplified and inserted into the pET-28a（+）vector to construct the prokaryotic expression plasmid pET28a-sIgM. The optimal expression condition was set as 0.05 mmol/ L IPTG, induced temperature 37℃, and induced time 4 hours.The recombinant sIgM fusion proteins was purified by His TrapTMHP column, and then identified by western blot using His-Tag Mouse mAb.

GIFT strain of Nile tilapia Immunoglobulin M Gene cloning Prokaryotic expression Western blot

2013-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41240041），廣東省科技計(jì)劃（2012B020308010），廣東省教育廳育苗項(xiàng)目（B12123）

王培，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制；E-mail：wangpei1108@163.com

簡(jiǎn)紀(jì)常，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制；E-mail：jianjc@gmail.com