郭向賀董穎胡紅霞趙艷珍

（1.河北農業(yè)大學海洋學院，秦皇島 066003；2.北京市水產科學研究所，北京 100068）

鱘魚種質鑒定方法研究進展

郭向賀1，2董穎2胡紅霞2趙艷珍1

（1.河北農業(yè)大學海洋學院，秦皇島 066003；2.北京市水產科學研究所，北京 100068）

鱘魚是一類古老的大型經濟魚類，由于過度捕撈和人類對其生態(tài)環(huán)境的破壞及其鱘魚自身具有的性成熟時間長、幼體成活率低等特點，使世界范圍內的鱘魚自然資源日趨枯竭。人工養(yǎng)殖鱘魚已是鱘魚制品的主要來源，但由于種質來源不清及大量雜交鱘的存在導致種質混亂情況比較嚴重，目前國內外均未有一套比較完善可行的鱘魚種質鑒定體系。總結了目前進行鱘魚種質鑒定的一些常用方法，分析了各個方法的優(yōu)缺點，為確立一套穩(wěn)定可靠的鱘魚種質鑒定方法奠定基礎。

鱘魚 種質 鑒定方法

鱘形目（Acipenseriformes）魚類是現存唯一的大型軟骨硬鱗魚，多數種類具有江河洄游的習性［1］。鱘魚肉厚鮮美，含豐富的蛋白質［2］，尤其是具有“黑色黃金”之稱的魚子醬，富含人體必需的多種氨基酸和不飽和脂肪酸（EPA、DHA）、無機鹽、維生素，以及多種必需微量元素，價格更是不菲［3］。但由于人類活動的影響致使鱘魚野外種質資源急劇下降，鱘形目多數種處于瀕危或極危狀態(tài)［4］。

隨著人們對鱘魚以及鱘魚魚子醬需求的增長，人工養(yǎng)殖鱘魚已經成為鱘魚制品的主要來源［5］。雖然鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，但由于沒有規(guī)范的養(yǎng)殖引種制度，而且國內外目前也還沒有一套完整的鱘魚種質鑒定體系［6］，使得鱘魚種質現狀繁雜，不利于鱘魚產業(yè)的進一步發(fā)展。為規(guī)范鱘魚貿易以及防止非法捕撈和交易，急需建立一套完整的鱘魚種質鑒定體系。目前，對鱘魚進行種質鑒定主要有形態(tài)學、SSCP、RAPD、RFLP、AFLP、微衛(wèi)星及物種特異性PCR等多種方法。本文主要對現在已有的各種鱘魚種質鑒定方法的應用情況和優(yōu)缺點進行綜述，以期為鱘魚種質鑒定找出最優(yōu)方案提供參考。

1 鱘魚現狀

鱘魚在早侏羅世已經存在（距今1.9-1.4億年），素有“活化石”之稱［7］。鱘魚隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）、輻鰭亞綱（Actinopterygii）、硬鱗總目（Chondrostei）、鱘形目（Acipenseriformes）?，F存的鱘魚有2科6屬27種，其中鱘科（Acipenseridae）有鰉屬（Huso）2種、鱘屬（Acipenser）18種、鏟鱘屬（Scaphirhynchus）2種、擬鏟鱘屬（Pseudoscaphirhynchus）3種；白鱘科（Polyodontidae）有白鱘屬（Psephurus）和匙吻鱘屬（Polyodon）各1種［8］。鱘魚主要分布在北回歸線以北的亞洲、歐洲和北美洲［9］。但是近幾年由于人類過度捕撈以及鱘魚棲息地被大型水利工程的興建和水環(huán)境污染等外界因素破壞，以及鱘魚性成熟晚、個體大且幼魚成活率低等因素，使得野生鱘魚種群數量急劇減少，已被列為《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ物種［10］。

鱘魚野生資源日益枯竭的同時，由于其重要的經濟價值，市場對鱘魚產品的需求卻逐年增加。因此人工養(yǎng)殖就成為解決鱘魚資源保護和市場需求間矛盾的唯一方法，前蘇聯、歐洲各國、美國及伊朗等國都相繼開展了鱘魚的人工養(yǎng)殖。我國從20世紀90年代開始開展鱘魚人工養(yǎng)殖，目前年產鱘魚商品魚約3萬 t，占世界總養(yǎng)殖產量的80%左右，已經成為了世界上最重要的鱘魚生產大國。但是現存的鱘魚都是多倍體，彼此間極易進行雜交，且產生的雜交種很難區(qū)分。而不同種類鱘魚及其雜交種的生長速度和適應條件各不相同，其經濟價值也不盡相同。例如，不同品種鱘魚卵加工制成的魚子醬的價格就相差懸殊，歐洲鰉的魚子醬價格超過5 000美元/kg，俄羅斯鱘的魚子醬約為4 000美元/kg，西伯利亞鱘的魚子醬約為3 000美元/kg，而小體鱘的魚子醬基本沒有市場。因此，進行正確的鱘魚種質鑒定是解決因種質混亂引起的糾紛及提高鱘魚產業(yè)價值的有效途徑。

2 種質鑒定方法

鱘形目自被記錄以來，人類發(fā)展出多種鱘魚的種質鑒定方法，從傳統(tǒng)的形態(tài)學到最新的分子生物學手段都有，本文就各個方法的應用以及優(yōu)缺點進行了概述。

2.1 形態(tài)學

動物形態(tài)學是生物學中具有悠久發(fā)展歷史的一門學科，從公元前4世紀亞里斯多德關于動物解剖的試驗記錄開始，到達爾文進化論使得動物形態(tài)學進入嶄新時期，再到20世紀初宏觀形態(tài)學研究的深入，已發(fā)展成為包括解剖學、比較解剖學、細胞學和組織學、古動物學和胚胎學等的綜合性學科［11］。形態(tài)學方法可簡單概括為可數性狀、可量性狀、結構特征等［12］。

Vasil'eva［13］根據鰓耙正面及側面的形態(tài)結構將其現有鱘魚分為4個類群，其鰓耙結構分別為圓錐形、扁寬形、樹形及鉤形。Artyukhin［14］通過比對嘴型、吻須位置、第一背骨板是否最大、卵的大小等28處形態(tài)學特征，對包括小體鱘、施氏鱘、達氏鰉、俄羅斯鱘等23種鱘屬進行了區(qū)分，并對形態(tài)學鑒定與分子鑒定的部分結果相悖的現象進行了解釋。陳細華［15］對27種鱘魚從受精卵到成體的形態(tài)學特征進行了詳細的描述及對比。

Gao等［16］利用中華鱘紅細胞的密度比其他鱘魚高的特點將其與其他鱘魚進行區(qū)分，Artyukhin等［17］從形態(tài)學角度對6種太平洋鱘魚進行研究，并討論庫頁島鱘在分類學的地位。張穎等［18］利用施氏鱘（♂）×達氏鰉（♀）雜交鱘特有表型將其與親本進行區(qū)分，雖然雜交鱘形態(tài)與母本更為接近，但仍可以通過比對頭部特征以及胸鰭、側骨板數、臀鰭條數等7項可數特征進行區(qū)分。

形態(tài)學方法雖然具有簡單、直觀等優(yōu)點，但因其判斷的主觀性強，需要較專業(yè)的系統(tǒng)學知識，且因地理隔絕或同種鱘魚不同發(fā)育階段形態(tài)學也有差異等因素的存在極易造成錯判，另外形態(tài)學也較難區(qū)分多種多樣的雜交鱘。

2.2 PCR-RFLP

限制性內切酶片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）作為第一代DNA遺傳標記法，由Grodjicker等［19］于1974年提出，是利用限制性內切酶消化不同品種或個體的同源分子，經電泳分離出不同的限制性片段。特別是RFLP與PCR結合，使得DNA多態(tài)性檢測更加直接、快速。

PCR-RFLP技術具有以下優(yōu)點：第一，可靠性較高，因為它由限制性內切酶切割特定位點產生；第二，來源于自然變異，依據DNA上豐富的堿基變異不需任何誘變劑處理；第三，多樣性，通過酶切反應來反映DNA水平上所有差異，在數量上無任何限制；第四，共顯性。但該技術的缺點是操作煩瑣，相對費時，具有種屬特異性，并且可能因為堿基突變而導致限制性酶切位點的丟失或獲得。

PCR-RFLP已應用到多種魚類的種質鑒定中，如大馬哈魚［20］、金槍魚［21］、海鱸［22］、鱈魚［23］等。在鱘魚種質鑒定中，PCR-RFLP技術主要被用來進行魚子醬品種的鑒定。Wolf等［24］利用不同限制性內切酶對俄羅斯鱘、施氏鱘、小體鱘、西伯利亞鱘等十種鱘魚的線粒體細胞色素b序列進行酶切，結果可以用于區(qū)分這些鱘魚的魚子醬制品。Ludwing等［25］利用7種限制性內切酶成功鑒別出22種鱘魚中的17種。

2.3 PCR-SSCP

單鏈構象多態(tài)性分析（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）是在1989年由日本學者Orita等［26］提出的，根據堿基改變會影響單鏈DNA空間構象的原理，使得空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受到不同阻力，導致電泳速度不同，經染色后就可以在凝膠上面檢測出結果。

PCR-SSCP具有以下優(yōu)點：第一，操作簡單，不需要特別儀器，技術容易掌握；第二，試驗步驟少，周期短；第三，可用非同位素方法檢測；第四，對己知和未知基因變異的檢測均有效，對DNA 原始材料純度要求不高，且所需量較少；第五，適合于大樣本篩查，特別適用于混合細胞群體中DNA 變異的檢測；第六，可分析DNA的多態(tài)性和DNA的突變［27，28］。但PCR-SSCP也具有不能識別堿基突變位置、較適用于300 bp短鏈DNA分析、結果易受多種因素影響等缺點。

Hara等［29］最先利用PCR-SSCP技術進行魚類鑒別。隨后，Rehbein等［30］利用PCR-SSCP技術進行了金槍魚的種質鑒定。Rehbein等［31］利用PCRSSCP技術對冷凍的4種鰻魚（歐洲鰻（Anguilla anguilla）、日本鰻（A.japonica）、美洲鰻（A.rostrata）、澳洲鰻（A.australis））和4種鮭魚（溪紅點鮭（Salvelinus fontinalis）、褐鮭（Salmo trutta）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鮭（Salmo salar））的肌肉組織、3種鱘魚（歐洲鰉、俄羅斯鱘和閃光鱘）的魚子醬以及沙丁魚、鯡魚、鱈魚、金槍魚和鰹魚的罐頭樣品進行種類鑒定，結果表明4種鰻魚在兩個條帶處差異明顯，5種鮭魚在3對引物擴增后可快速鑒別出，3種鱘魚的條帶差異明顯，其中歐洲鰉在不用DNA變性的情況下可輕易獲得指紋圖譜，其他的罐頭樣品也可從兩個條帶的強弱進行區(qū)分。Rehbein等［32］利用線粒體細胞色素b區(qū)域擴增出的兩段序列進行PCR-SSCP分析，可以對俄羅斯鱘、小體鱘、歐洲鰉、閃光鱘和裸腹鱘的魚子醬進行區(qū)分，這兩段擴增序列（小于150 bp）既保證了單個堿基替換對單鏈DNA空間結構的影響，同時也可以降低過長片段對種內鑒定的誤差。

2.4 RAPD

隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術是由Williams［33］和Welsh［34］在1990年分別提出的，它的原理是：對于同一模板DNA，用一個特定引物進行擴增所得到的電泳帶譜應是一致的，引物不同則帶譜就會有差異。該技術利用大量各不相同的隨機短引物（8-10 bp），以待研究的基因組DNA片段為模板進行PCR擴增，擴增產物經電泳分離后即可進行多態(tài)性分析。RAPD技術具有以下優(yōu)點：第一，操作簡便，試驗周期短，能在較短的時間內篩選大量樣品；第二，所需樣品量極少；第三，引物具普遍適應性；第四，不必事先了解目的基因和片段序列；第五，適應于自動化操作和分析。但該技術的缺點是結果不易重復、多態(tài)性較低，而且是顯性標記。

RAPD技術已經被用于鯉魚［35］、鯰魚［36］、羅非魚［37］、古比魚［38］等魚類的種質鑒定中。Van等［39］利用RAPD技術成功區(qū)分出白鱘的雌核發(fā)育和多倍體群體。而Comincini等最早將RAPD技術用于鱘魚的種質鑒定，成功對俄羅斯鱘、波斯鱘、閃光鱘、裸腹鱘等進行鑒別［40］。Barmintsev等［41］將該技術進一步發(fā)展，使其不僅適用于鱘魚的種質鑒定，還適用于對鱘魚種群、雜交種甚至是鱘魚制品的鑒定。

2.5 AFLP

擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術結合了RFLP和RAPD各自的優(yōu)點，是由Zabeau和Vos［42］在1993年發(fā)明并發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的技術。其基本原理是模板DNA由于突變等原因導致酶切位點的改變，因此在限制性內切酶的作用下將產生大小不等的片段，從而反映模板DNA的多態(tài)性。AFLP技術具有需要DNA量小、擴增效率高、多態(tài)帶比例高、可靠性好、樣品適用性廣、穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點。但其缺點是它不是共顯性標記，且對模板DNA的質量要求較高。

AFLP技術已用于虹鱒魚［43］、鯰魚［44］、羅非魚［45］等魚類的種質鑒定。Congiu等［46］最先利用AFLP技術成功區(qū)分高首鱘、納氏鱘及其雜交品種。而后，AFLP技術被用于對小體鱘、俄羅斯鱘、高首鱘、歐鰉、歐洲大西洋鱘、大西洋鱘、納氏鱘、閃光鱘、短吻鱘和西伯利亞鱘等進行區(qū)分，并延伸到對魚子醬和熏魚肉等鱘魚制品的鑒別［47］。

2.6 微衛(wèi)星

微衛(wèi)星DNA標記（Microsatellite），也稱為短串聯重復序列（Simple tandem repeats，STRs）或簡單重復序列（simple sequence repeats，SSRs），最先由Litt等［48］提出，一般以2-6個堿基為核心序列，首尾相連串聯重復，存在于幾乎所有真核生物的基因組中，豐度高，且呈隨機均勻分布［49］。微衛(wèi)星具有數量多且分布均勻、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、遵循孟德爾遺傳定律以及具有一定的保守性等優(yōu)點。其缺點是特異性引物的篩選費時費力，以及可能產生同源異型或者異源同型現象等。

微衛(wèi)星多被用于遺傳多樣性分析，但也可用于種質鑒別。Maltagliati等［50］利用微衛(wèi)星標記對地中海瀕危魚類西班牙鳉（Valencia hispanica）、利氏西班牙鳉（V. letourneuxi）和斑條秘鳉（Aphanius fasciatus）進行區(qū)別。Jenneckens等［51］發(fā)現一個具有種特異性的微衛(wèi)星引物用來鑒別閃光鱘及其魚子醬制品。胡佳等［52］采用微衛(wèi)星標記結合線粒體控制區(qū)同源序列比對的方法，可以很好地鑒別出施氏鱘、達氏鰉及其正反交子代。

2.7 物種特異性PCR

物種特異性PCR技術是通過對需要辨認的物種及其近緣種的某段序列進行比對，根據PCR引物設計原則針對其中有差異的區(qū)域設計引物，從而得到具有物種特異性的引物，使得在PCR反應過程中只有目的物種的DNA可以與引物正常退火并延伸，而其他物種的DNA不能與引物匹配或匹配后擴增得到的產物與目的物種的擴增產物存在較大的長度差異，通過是否擴增成功或其產物的大小差異來鑒定目的物種。物種特異性PCR技術具有操作簡單、物種特異性強以及高靈敏度等特點，但由于其主要以線粒體DNA作為種質鑒定的模版來源，而鑒于線粒體DNA母系遺傳的特點［53］，此方法無法用于鑒別雜交種。

Hubalkova等［54］利用Pan Ⅰ序列設計的物種特異性引物對阿拉斯加狹鱈（Theragra chalcogramma）、藍鱈（Micromesistius poutassou）、無須鱈（Merlucciusspp.）、大西洋真鱈（Gadus morhua）、綠青鱈魚（Pollachius virens）和牙鱈（Merlangius merlangus）進行擴增，成功對上述幾種鱈魚進行了區(qū)分。其他可以利用物種特異性PCR進行種質鑒別的還有鰹魚［55］、鯊魚［56］、三文魚和鱒魚［57］等。DeSalle和Birstein等［58，59］利用物種特異性PCR對俄羅斯鱘、閃光鱘、歐洲鰉等進行了種質鑒定。Mugue等［60］利用線粒體DNA的D-loop片段特性設計的物種特異性引物對俄羅斯鱘、達氏鰉、小體鱘、西伯利亞鱘、歐洲鰉、施氏鱘、閃光鱘和裸腹鱘等八種鱘的魚子醬產品進行鑒定。

2.8 實時定量PCR

Higuchi 等［61］首次利用EtBr（溴化乙錠）演示了實時定量PCR（Quantitative real-time PCR）的實時過程，典型的實時定量PCR方法包括引物的設計與合成、反轉錄合成cDNA、PCR反應混合液的配制、核酸擴增、DNA條帶檢測等幾步。實時定量PCR檢測技術具有快速、靈敏度高、特異性強、重復性好等優(yōu)點。

實時定量PCR技術已被成功應用于黑線鱈（Melanogrammus aeglefinus）［62］、歐洲無須鱈（Merluccius merluccius）［63］、 大 西 洋 鱈（Gadus morh-ua）［64］、金槍魚［65］、三文魚和鱒魚［57］等魚類的種質鑒定中。雖然目前尚未見到其在鱘魚種質鑒定中的應用報道，但作為一種有效的魚類種質快速檢測技術，其發(fā)展前景十分可觀，可作為進行鱘魚種質鑒定的候選技術。

2.9 DNA-barcoding

DNA條形碼（DNA-barcoding）技術自加拿大動物學家Hebert等［66］提出以來，已被廣泛應用在鳥類、哺乳動物、魚類、軟體動物及昆蟲等不同生物群體中。該技術主要利用線粒體COⅠ序列很少存在插入和缺失等現象，且長度適合及進化率低等特點，利用其中一段短的DNA序列作為物種快速鑒定的標記，并希望以此建立起物種名稱（條形碼）和生物實體之間一一對應的關系［14］。DNA條形碼技術具有鑒定過程快捷、準確率高等優(yōu)點。

Ward等［67］利用DNA條形碼技術對澳大利亞273 種魚類的COⅠ基因序列進行了分析，不僅成功鑒別出這些魚類，而且還對其系統(tǒng)發(fā)育進行了研究，對了解其進化歷程提供了信息參考。程鵬等［68］對北京市懷柔區(qū)的53種魚類進行了研究發(fā)現，條形碼鑒定與形態(tài)鑒定基本一致，同時DNA條形碼技術還彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學鑒別的缺陷，為魚類保護以及新物種的發(fā)現提供了新的解決方法。

雖然DNA條形碼技術存在包括條形碼數據庫缺乏、無法鑒別雜交種、條形碼價格昂貴等缺點，但該技術已經成為生態(tài)學研究和物種鑒定的重要工具。同時，由于其具有的良好對應性，即一段條形碼只對應一個物種，使得其可能成為世界通用的種質鑒定標記，特別是在鱘魚魚子醬的全球貿易中具有巨大的應用前景，將成為研究的熱點之一。

3 展望

與大多數魚類不同，鱘形目魚類種間甚至屬間的雜交現象極為普遍，且部分雜交種仍可育，產生三雜交后代，這為進行鱘魚種質鑒定造成了極大的困難。通過對上述幾種鱘魚種質鑒別方法的綜述發(fā)現，目前還沒有一種方法適用于所有鱘魚品種的種質鑒定，但可以對比幾種常用的種質鑒定方法的優(yōu)缺點，利用優(yōu)缺點互補的原則通過兩種或多種方法相結合，找出最優(yōu)組合，使之適用于對所有鱘魚特別是雜交鱘品種進行種質鑒定。由于不能辨別父本，單獨使用遵循母系遺傳的線粒體DNA標記不能區(qū)分出雜交鱘；而利用核DNA標記（如微衛(wèi)星、AFLP等）雖然可以知道親本種類，但不能明確哪個是父本哪個是母本。因此，我們認為應該將線粒體DNA標記與核DNA標記結合使用，即先通過線粒體DNA標記確定母本種類，再通過核DNA標記確定父本種類并最終確定樣本的種類，這可能是準確進行鱘魚種質鑒定的好方法。但是究竟選取哪些核DNA標記以及線粒體的哪個區(qū)域進行分析還需要進一步的驗證。

另外，將PCR技術與高分辨率的色譜和質譜技術相結合，可作為未來鱘魚種質鑒定的探索方向。而具有快捷、準確率高等優(yōu)點的實時定量PCR技術和DNA條形碼技術也可能成為未來鱘魚種質鑒別，特別是魚子醬產品鑒別的熱點技術。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progresses of Germplasm Identification Methods in Sturgeons

Guo Xianghe1，2Dong Ying2Hu Hongxia2Zhao Yanzhen1
（1. Ocean College，Agricultural University of Hebei，Qinhuangdao 066003；2. Beijing Fisheries Research Institute，Beijing 100068）

Sturgeon is a kind of large economic fish. Due to overharvesting, habitat destruction and their biological characteristics such as sexual maturation at a late age and low survival rate of larvae, sturgeon natural resources in the world were depleting. In order to meet the needs of sturgeon caviar and meat, artificial cultivations were developed and had been the main source of sturgeon products. So far, there was not yet a perfect germplasm identification method in sturgeons at home and abroad. Some common sturgeon germplasm identification methods were summarized. The advantages and disadvantages of each method were analyzed and listed. It was helpful to establish a stable and reliable sturgeon germplasm identification method.

Sturgeon Germplasm Identification methods

2013-08-26

北京市科技計劃（D121100003712002），北京市鱘魚鮭鱒魚創(chuàng)新團隊（SCGWZJ 20121102-1），科技部支撐計劃（2012BAD26B05）

郭向賀，男，碩士研究生，研究方向：魚類遺傳育種；E-mail：guoxianghe@126.com

胡紅霞，女，博士，研究員，研究方向：魚類遺傳育種；E-mail：huhongxia@bjfishery.com

趙艷珍，女，副教授，研究方向：水生生物種質資源和漁業(yè)環(huán)境及其調控；E-mail：zhaoyanzhen5532@163.com