萬(wàn)婧相興偉江玲麗周向陽(yáng)

（1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，舟山 316000；2.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，舟山 316000）

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在復(fù)合體重組表達(dá)應(yīng)用中的研究進(jìn)展

萬(wàn)婧1相興偉2江玲麗1周向陽(yáng)1

（1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，舟山 316000；2.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，舟山 316000）

真核細(xì)胞大部分生命活動(dòng)是通過(guò)復(fù)合體催化的。因此，系統(tǒng)了解這些復(fù)合體的生物學(xué)功能，將在健康和疾病方面具有重要意義。由于內(nèi)源性復(fù)合體存在低豐度和異質(zhì)性特點(diǎn)，因而直接提取復(fù)合體存在一定的困難。桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可成功表達(dá)復(fù)合體，為研究復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能提供新的手段。綜述近年來(lái)利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能研究的進(jìn)展。

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 復(fù)合體 晶體結(jié)構(gòu) 功能

異源表達(dá)系統(tǒng)目前已成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究工具，對(duì)蛋白質(zhì)功能研究具有深遠(yuǎn)影響。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是蛋白表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的，現(xiàn)已成功開(kāi)發(fā)了許多表達(dá)質(zhì)粒和相應(yīng)的宿主菌。目前，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//www. rcsb.org/）收錄的蛋白大多數(shù)是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的。隨著復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能研究趨勢(shì)的日益增加，原核表達(dá)系統(tǒng)在大分子量蛋白亞基的表達(dá)、翻譯后修飾，以及多個(gè)蛋白亞基同時(shí)表達(dá)等方面存在缺陷。因此，有必要利用功能更強(qiáng)大的真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)復(fù)合體，該系統(tǒng)能夠滿足結(jié)構(gòu)研究所需數(shù)量和質(zhì)量的復(fù)合體。

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是將外源目的基因插入桿狀病毒載體中，轉(zhuǎn)染入昆蟲(chóng)細(xì)胞中對(duì)單個(gè)蛋白或者蛋白復(fù)合體進(jìn)行高量表達(dá)的真核表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)自問(wèn)世以來(lái)應(yīng)用廣泛，在過(guò)去幾年中成為了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主流。進(jìn)行復(fù)合體結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究需要考慮樣品的制備、實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化、蛋白復(fù)合體表達(dá)的成本以及所需的時(shí)間等。目前通過(guò)改造桿狀病毒基因組提高蛋白質(zhì)復(fù)合體的表達(dá)、開(kāi)發(fā)多基因組裝的新質(zhì)粒、建立細(xì)胞培養(yǎng)、病毒傳代、病毒感染和重組蛋白生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，使桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中易于使用的常規(guī)操作工具［1］。MultiBac是一種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，是在Bac-to-Bac的基礎(chǔ)上通過(guò)改造轉(zhuǎn)移載體和Bacmid，實(shí)現(xiàn)真核多蛋白復(fù)合體或者單個(gè)基因多拷貝在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的有力工具，由2個(gè)供體載體pFBDM和pUCDM和改造過(guò)的受體Bacmid組成。目前，已利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)多種蛋白質(zhì)復(fù)合體并進(jìn)行相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能研究。如釀酒酵母轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的頭部模塊、酵母細(xì)胞分裂后期啟動(dòng)復(fù)合體APC/C和人轉(zhuǎn)錄因子TFIID核心支架復(fù)合體等。本文將從這幾種復(fù)合體闡述桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 釀酒酵母轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的頭部模塊

轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體是由多個(gè)在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的亞基組成的蛋白復(fù)合體。在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體分別與基因特異的轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II相互作用，是真核生物基因轉(zhuǎn)錄的中央控制器［2-4］。于釀酒酵母中首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體，其由21個(gè)亞基構(gòu)成，分子量超過(guò)1 MD［5，6］。研究證明，轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體個(gè)別亞基的突變，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥［7-14］。因此，闡明轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的功能是一個(gè)重大的生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題。但由于轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的大分子量、高復(fù)雜性和低豐度的特點(diǎn)阻礙了其生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)的研究。

單粒子電子顯微鏡首次呈現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，與RNA聚合酶II的結(jié)構(gòu)不同，其是緊湊型的球狀結(jié)構(gòu)。酵母中的轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體由頭部、中部和尾部3個(gè)模塊構(gòu)成［15，16］。結(jié)構(gòu)學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究證明每個(gè)模塊由7-9個(gè)單獨(dú)的亞基構(gòu)成（圖1-a）。轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體參與細(xì)胞內(nèi)的多種細(xì)胞活動(dòng)，每個(gè)模塊執(zhí)行各自相應(yīng)的功能［17］。例如，頭部模塊的亞基與RNA聚合酶C端區(qū)域相互作用［18，19］，而中部和尾部模塊的亞基直接與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生相互作用［4，20-23］。因此，可通過(guò)分別研究各個(gè)模塊的功能，以期進(jìn)一步闡明整個(gè)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能，這種策略明顯降低了研究整個(gè)轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性。

1.1 在昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的頭部模塊

轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的頭部模塊由7個(gè)亞基構(gòu)成，分別為Med17、Med6和Med8，Med11、Med22、Med18和Med20，分子量為223 kD。起初采用桿狀病毒共同感染的方法，即將7種不同的重組病毒（每種編碼一種亞基）共同感染昆蟲(chóng)細(xì)胞［24］。然而，這種方法的試驗(yàn)流程和操作步驟是極其漫長(zhǎng)的，而且使得7種重組病毒的滴度保持平行是非常困難的。此外，進(jìn)行X-射線晶體學(xué)研究，需要在盡可能短的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量的復(fù)合體。因此，利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，在同一個(gè)桿狀病毒中同時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體頭部模塊的亞基將會(huì)從根本上解決上述問(wèn)題。MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)串聯(lián)重組技術(shù)極大方便了多個(gè)基因盒的快速串聯(lián)重組拼裝［1］。通過(guò)串聯(lián)重組將編碼轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體頭部模塊亞基的所有基因組合到單個(gè)桿狀病毒結(jié)構(gòu)中（圖1-b）［25，26］，顯著降低了試驗(yàn)的復(fù)雜性。將多基因結(jié)構(gòu)整合到MultiBac桿狀病毒的基因組中，能有效的減少蛋白質(zhì)的水解并延長(zhǎng)宿主細(xì)胞的裂解，有助于提高重組蛋白復(fù)合體的質(zhì)量［1］。最后將重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，在細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的頭部模塊（圖1-b）。

1.2 重組轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體頭部模塊的結(jié)構(gòu)

重組復(fù)合體生產(chǎn)的簡(jiǎn)化推動(dòng)了頭部模塊晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定，消除MED17 和MED18的柔韌區(qū)可獲得良好有序的單晶結(jié)構(gòu)，這有利于衍射數(shù)據(jù)的收集（圖1-c）。此外，在重組產(chǎn)生的蛋白樣品中加入硒基-L-甲硫氨酸有助于結(jié)構(gòu)的測(cè)定。轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體頭部模塊晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定，揭示了這一具有組件結(jié)合穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靈活性的重要復(fù)合體是如何組建的，為其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)的測(cè)定提供了一個(gè)平臺(tái)［26］。值得注意的是，頭部模塊中的5個(gè)亞基同時(shí)存在于一個(gè)緊湊的結(jié)構(gòu)單元，將其命名為頸部區(qū)域。該區(qū)域通過(guò)形成一個(gè)新的多螺旋束，使得轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體具有穩(wěn)定性和完整性（圖1-c）。

2 后期促進(jìn)復(fù)合體（APC/C）

APC/C是遍在蛋白連接酶復(fù)合體，由多個(gè)亞基構(gòu)成，通過(guò)蛋白酶體依賴式水解細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程［27-29］。APC/C至少由13種不同的蛋白亞基構(gòu)成，APC激發(fā)E2-遍在蛋白復(fù)合體同有絲分裂周期蛋白破壞框結(jié)合，然后激發(fā)遍在蛋白同破壞框C末端的賴氨酸殘基結(jié)合，此過(guò)程不斷循環(huán)使遍在蛋白多聚化。真核生物中APC/C是高度保守的，由于某些蛋白亞基具有兩個(gè)拷貝。因此，整個(gè)APC/C由18-19個(gè)亞基組成，分子量范圍在1-1.2 MD之間［30］。

2.1 利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組APC/C

APC/C大部分亞基分子量較大，遺傳操作性難度高，內(nèi)源性豐度低，這些因素限制了APC/C的結(jié)構(gòu)和生化研究。近年來(lái)發(fā)展的基于MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，可以重組產(chǎn)生釀酒酵母以及人的APC/C，這極大地推動(dòng)了APC/C的結(jié)構(gòu)學(xué)、生化學(xué)和生理學(xué)的發(fā)展［30，31］。利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)了釀酒酵母的APC/C，即通過(guò)構(gòu)建兩種分別編碼5個(gè)亞基和8個(gè)亞基的重組病毒進(jìn)行共表達(dá)。利用重組共表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的完整APC/C的產(chǎn)量是內(nèi)源性的200多倍，達(dá)到0.5 mg/L。通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)比較分析釀酒酵母的內(nèi)源性和重組APC/C，發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)的復(fù)合體是正確組裝的（圖2-a 和圖2-b）。而且在激活劑存在的條件下，以一種D box和 KEN box依賴的方式實(shí)現(xiàn)有絲分裂細(xì)胞周期蛋白的泛素化［30］。利用重組的APC/C能夠重塑內(nèi)源性APC/C的催化和調(diào)節(jié)功能，而且明確了釀酒酵母APC/C的分子組成，對(duì)全面系統(tǒng)的了解APC/C具有重要意義。

2.2 解析重組酵母的APC/C

重組表達(dá)整個(gè)和部分APC/C，得以精確測(cè)定APC/C的質(zhì)量。質(zhì)樸分析含有8個(gè)亞基的APC/C部分復(fù)體，測(cè)定的分子量為698.8 kD，與所有亞基的化學(xué)計(jì)量法所得的結(jié)果是一致的［30］。根據(jù)APC/C的結(jié)構(gòu)圖重組產(chǎn)生了APC/C的部分復(fù)體，明確了三維APC/C中每個(gè)亞基的分子邊界。例如，Cdc16-Cdc26的差異密度密切對(duì)應(yīng)Cdc16-Cdc26異源四聚體的晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)差異密度可比較兩個(gè)APC/C部分復(fù)合體的差異（圖2-c）。通過(guò)亞基刪除策略，可以系統(tǒng)的調(diào)配APC/C的大部分亞基。通過(guò)整合APC/C單個(gè)亞基同源模型的晶體結(jié)構(gòu)，利用冷凍電子顯微鏡在10 ?的分辨率下重塑APC/CCdh1.D-box三元復(fù)合體［32］，解析了高分辨率的APC/C亞基組成和原子模型［30，32］（圖2-d）。亞基刪除策略可精確界定APC/C亞基的分子邊界，相較于N端和C端標(biāo)記粗略定位亞基的方法，該策略使得亞基原子模型的對(duì)接更準(zhǔn)確可靠。

2.3 利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人的整個(gè)APC/C

近期，兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用昆蟲(chóng)/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和重構(gòu)人的APC/C［31，33］。其中一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用MultiBac的pFBDM 和pUCDM載體構(gòu)建了多基因表達(dá)載體［34］，并利用USER連接依賴式的克隆方法［35，36］將所有的14個(gè)基因插入兩個(gè)重組病毒［31］。而另一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了14種重組病毒，每種重組病毒表達(dá)單個(gè)APC/C亞基，然后將所有的重組病毒共同感染昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行生化研究［33］。通過(guò)此種方法，明確Apc15 和Apc16也為人APC/C的組分。在鑒定Apc16之前，嘗試構(gòu)建完整組裝的人重組APC/C無(wú)法獲得成功［31］。這表明Apc16定位于TPR部分復(fù)合體中［37］，是人APC/C精確組裝所必需的。因此，利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可重構(gòu)正確組裝的人APC/C，表明APC/C發(fā)揮功能所必需的所有亞基都得到了鑒定（圖2-e和圖2-f）。

2.4 有絲分裂期檢驗(yàn)點(diǎn)復(fù)合體（MCC）的X-射線結(jié)構(gòu)

染色體分離的過(guò)程由一種被稱為紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)的系統(tǒng)控制，通過(guò)MCC抑制APC/C，以確保子細(xì)胞獲得正確數(shù)目的染色體［38］。MCC組分包括：APC/C 共激活劑 Cdc20以及檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白Mad2、Mad3（BubR1）、Bub3和激酶Bub1，Mph1（Mps1）和 Aurora B。利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)釀酒酵母MCC，其晶體結(jié)構(gòu)表明Cdc20，Mad2 和Mad3組裝成為三角形的異源三聚體（圖2-g）［39］。Mad3通過(guò)與Mad2 和Cdc20形成許多亞基內(nèi)的相互作用協(xié)調(diào)整個(gè)復(fù)合體，其N端區(qū)域的螺旋-環(huán)-螺旋模體可同時(shí)結(jié)合Mad2和Cdc20。

3 人通用轉(zhuǎn)錄因子TFIID

RNA聚合酶II（Pol II）啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄需步進(jìn)式組裝的前起始復(fù)合體，該復(fù)合體由Pol II、TBP及通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIA、B、D、E、F和H構(gòu)成［41-43］。其中TFIID是啟動(dòng)子識(shí)別復(fù)合體，是前體復(fù)合體組裝的基石，作為共激活劑介導(dǎo)信號(hào)的傳遞。人的TFIID由14個(gè)蛋白亞基構(gòu)成，由TATA-box結(jié)合蛋白（TATA-box binding protein，TBP）和TBP協(xié)同因子（TBP-associated factors）在體內(nèi)裝配為復(fù)合體，分子量約為1.6 MD。TFIID可識(shí)別和結(jié)合核心啟動(dòng)子，指導(dǎo)其他通用轉(zhuǎn)錄因子參與組裝［43］。

目前，對(duì)TFIID的精細(xì)分子模型、在細(xì)胞中的組裝，與染色質(zhì)和其他因子互作的機(jī)制還了解甚少。研究TFIID在轉(zhuǎn)錄中的作用，有助于進(jìn)一步理解基因表達(dá)調(diào)控。利用透射電鏡解析人類和酵母TFIID的整體形狀，都為類似于分子鉗的非對(duì)稱三裂結(jié)構(gòu)［43］。細(xì)胞中內(nèi)源性TFIID的水平非常低且復(fù)合體分子量大，阻礙了研究人員在分子細(xì)節(jié)上破譯其結(jié)構(gòu)和功能。

目前，關(guān)于TFIID內(nèi)亞基拷貝數(shù)的共識(shí)是：TAFs的 子 集（TAF4、TAF5、TAF6、TAF9和TAF12）含有兩個(gè)拷貝，而TBP和剩余的TAFs含有一個(gè)拷貝［41］。由于人類和酵母TFIID復(fù)合體的進(jìn)化保守性以及形狀的整體相似性，推測(cè)所有物種的該復(fù)合體的亞基組成是類似的。研究人員利用RNAi技術(shù)敲除體外培養(yǎng)的果蠅組織的TFIID特異亞結(jié)構(gòu)［44］，發(fā)現(xiàn)TAF4，TAF5，TAF6，TAF9和TAF12組成一個(gè)穩(wěn)定的TFIID核心支架復(fù)合體，對(duì)維持復(fù)合體穩(wěn)定性起到關(guān)鍵性作用。TFIID核心支架復(fù)合體存在兩個(gè)對(duì)稱的拷貝，而剩余的TAFs和TBP作為外圍亞基，這暗示了TFIID在組裝過(guò)程中可能發(fā)生了一個(gè)對(duì)稱到非對(duì)稱的過(guò)渡。此外，利用冷凍電子顯微鏡研究酵母的TFIID，也觀察到相對(duì)較小的對(duì)稱結(jié)構(gòu)［45］。這些結(jié)果表明，對(duì)稱TFIID核心支架復(fù)合體的存在對(duì)整個(gè)復(fù)合體的完整性和組裝是至關(guān)重要的。最近，研究人員通過(guò)單顆粒冷凍電子顯微鏡，發(fā)現(xiàn)TFIID轉(zhuǎn)錄因子有兩種不同的結(jié)構(gòu)狀態(tài)并存（標(biāo)準(zhǔn)態(tài)和重排態(tài)）。這一結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換能夠起始轉(zhuǎn)錄，將DNA的遺傳學(xué)信息轉(zhuǎn)錄到RNA中以便進(jìn)行蛋白合成，展示了轉(zhuǎn)錄因子組合調(diào)控基因表達(dá)水平從而增加多樣性的機(jī)制［46］。

利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、冷凍電子顯微鏡、X-射線晶體學(xué)和同源模型分析方法，解析人類TFIID核心支架復(fù)合體由10個(gè)亞基組成，分別為兩個(gè)拷貝的TAF4、5、6、9和12［48］（圖3）。起初，通過(guò)單個(gè)桿狀病毒構(gòu)建多基因表達(dá)盒，表達(dá)TFIID核心支架復(fù)合體［34］，與釀酒酵母轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體頭部模塊的研究方法是相似的［26］。然而，單個(gè)亞基的表達(dá)水平差異很大，導(dǎo)致整個(gè)重組復(fù)合體的產(chǎn)量明顯降低。相對(duì)于含有所有亞基的正常組裝的復(fù)合體的表達(dá)水平，單個(gè)亞基的表達(dá)水平是很高的。利用親和標(biāo)簽標(biāo)記低表達(dá)量的亞基，可提高TFIID核心支架復(fù)合體的產(chǎn)量。然而，電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)小標(biāo)簽的存在干擾復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。

解決這一瓶頸的方法來(lái)自于研究如冠狀病毒等某些病毒時(shí)所采用的策略。當(dāng)病毒復(fù)制時(shí)，可以表達(dá)長(zhǎng)的開(kāi)放式閱讀框而形成多聚蛋白，這些多聚蛋白經(jīng)過(guò)高度特異性蛋白酶的加工成為單個(gè)功能性多肽。MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)就應(yīng)用這一策略，將編碼煙草蝕紋病毒NIa蛋白酶的基因以及相應(yīng)的識(shí)別和切割序列插入到長(zhǎng)的開(kāi)放式閱讀框的5'端［1，49］。為了便于觀察和定量多聚蛋白的表達(dá)，在ORF的3'端插入編碼綠色熒光蛋白的基因（圖3-a）。結(jié)果表明煙草蝕紋病毒NIa蛋白酶可有效、特異地加工多聚蛋白，而且通過(guò)綠色熒光的強(qiáng)度可以定量多聚蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)這一策略獲得了極其豐富的、正確裝配的TFIID核心支架復(fù)合體（包含10個(gè)亞基），并利用電子顯微鏡和X射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行高分辨率分析（圖3-b和圖3-c）。TFIID核心支架復(fù)合體的結(jié)構(gòu)是對(duì)稱的，而TAF8和TAF10的結(jié)合破壞了TFIID核心支架復(fù)合體原有的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，通過(guò)吸收剩余的TAFS和TBP，使得整個(gè)TFIID復(fù)合體的結(jié)構(gòu)是非對(duì)稱的［48］。

4 結(jié)語(yǔ)

研究人員首先利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)釀酒酵母轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體的頭部模塊，然后利用冷凍電子顯微鏡和X-射線晶體學(xué)成功解析釀酒酵母轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體頭部模塊的晶體結(jié)構(gòu)：其由Med17、Med11、Med22、Med6、Med8、Med18和Med20組成，包括固定爪、活動(dòng)爪和頸部3個(gè)區(qū)域，其中頸部區(qū)域形成一個(gè)新的多螺旋束［26］。按照同樣的思路，成功解析細(xì)胞分裂后期啟動(dòng)復(fù)合體APC/C和人轉(zhuǎn)錄因子TFIID核心支架復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。可見(jiàn)，MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已成為復(fù)合體結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的強(qiáng)有力工具。

進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究需要大量高豐度的均一化樣品，才能得到高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)信息。電子顯微鏡、單粒子分析和質(zhì)譜分析不需要高豐度蛋白樣品，但對(duì)樣品的均一化程度要求較高［47］。同樣，蛋白的功能研究和藥物應(yīng)用同樣需要高度均一化的蛋白樣品。細(xì)胞大部分生命活動(dòng)通過(guò)蛋白質(zhì)復(fù)合體實(shí)現(xiàn)，而對(duì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能的詳盡研究主要依賴于重組表達(dá)。然而，內(nèi)源性復(fù)合體存在低豐度和異質(zhì)性特點(diǎn)，因而直接提取復(fù)合體存在一定的困難。利用MultiBac桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以明確界定復(fù)合體的亞基組成，增加蛋白樣品的產(chǎn)量和均一化。此外，加工和突變特定的亞基可明確其在復(fù)合體中的功能和精細(xì)定位，這對(duì)全面了解復(fù)合體的生物學(xué)功能至關(guān)重要。

利用桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)真核生物的復(fù)合體，能夠符合結(jié)構(gòu)晶體學(xué)研究所需的質(zhì)量和數(shù)量。近年來(lái)，真核表達(dá)技術(shù)獲得了長(zhǎng)足發(fā)展，為其他關(guān)鍵復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了新的思路，也為結(jié)構(gòu)晶體學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advances on the Baculovirus Expression Vector System for Protein Complex Production

Wan Jing1Xiang Xingwei2Jiang Lingli1Zhou Xiangyang1
（1. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316000；2. Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316000）

Most essential functions of eukaryotic cells are catalyzed by complex built of many subunits. To well understand their biological function in the process of health and disease, it is imperative to study these complexes. The low abundance and heterogeneity of many essential complexes have limited their extraction from native source material. The baculovirus expression vector system（BEVS）, specifically tailored for multiprotein complex production, has been proven itself to be uniquely suited for overcoming this impeding bottleneck. Here we highlight recent major achievements in multiprotein complex structure research which were catalyzed by this versatile recombinant complex expression tool.

Baculovirus expression vector system Complex Crystal structure Function

2013-8-18

浙江省重大科技專項(xiàng)（2011C13027-1）

萬(wàn)婧，女，碩士研究生，研究方向：微生物與食品安全；E-mail：wanjing9687@126.com

周向陽(yáng)，男，高級(jí)工程師，研究方向：微生物與食品安全；E-mail：zxy@zs.ziq.gov.cn