鄒月利，徐雅琴，白靖文，趙李霞

(東北農(nóng)業(yè)大學 理學院， 哈爾濱 150030)

隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，高效液相色譜(HPLC)作為一種具有高靈敏度、高選擇性和高效快速分離的檢測技術(shù)得到了長足的發(fā)展，現(xiàn)已成為我國高等農(nóng)業(yè)院?；瘜W化工專業(yè)應用最廣泛的分析方法［1］。它既能用于微量組分的分析測定，又能用于大量的制備分離，其應用范圍已超過其他各種分離檢測方法，尤其在生化醫(yī)藥樣品的分析、分離方面更能充分發(fā)揮特長，目前廣泛應用于食品安全、化學分析、環(huán)境科學、農(nóng)藥殘留和石油化工等領(lǐng)域［2］。

高效液相色譜儀的科學管理和正確使用維護，是獲得良好色譜分離效果和延長儀器使用壽命的前提和基礎(chǔ)?；瘜W實驗中心于2012年12月對所有大型精密儀器設(shè)備實施網(wǎng)上預約共享管理模式，已經(jīng)取得了良好的運行效果。雖然液相色譜儀的種類繁多，但是它們的管理方法與使用維護是一致的。本文結(jié)合對該實驗室Agilent 1100高效液相色譜儀十幾年的管理和使用經(jīng)驗，較詳細地介紹了高效液相色譜儀在日常管理和使用維護等方面的一些體會，希望與同行們共享［3－4］。

1 管理與維護

化學實驗中心在液相色譜儀的管理上，要求所有用戶在使用儀器前必須仔細閱讀操作流程，按具體要求進行操作。本科生一律在指導教師的陪同下方可使用，不得單獨操作。

1.1 流動相

1)所用流動相必須經(jīng)0.45 μm微孔濾膜真空抽濾2～3次，然后用超聲儀超聲45～60 min后，方可作為流動相使用［5］。

2)甲醇、乙腈等有機溶劑必須為色譜純，當用酸或者堿來調(diào)節(jié)流動相pH值時，范圍一定不能超過2～7.5。水則必須為去離子水，使用期限不得超過2 d，逾期則要重新配制。

3)流動相瓶口不準用密封帶封死，以保證內(nèi)外壓力相等。不要隨便更換流動相接口，A瓶(棕色)固定為水，B瓶(白色)固定為甲醇或乙腈;流動相的流速不要超過3.0 mL/min。

4)流動相禁止使用氯仿、三氯(代)苯、亞甲基氯、四氫呋喃、甲苯等;慎重使用四氯化碳、乙醚、異丙醚、丙酮、甲基環(huán)己胺等，以免造成對柱塞密封圈的腐蝕。

5)當有緩沖鹽做流動相時，緩沖溶液與有機溶劑互相轉(zhuǎn)換前一定要用5 甲醇清洗泵，防止鹽在有機相中結(jié)晶損壞泵中各組件。緩沖溶液的濃度不能高于0.5 mol/L，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。Cl－的濃度要小于0.1 mol/L(防止腐蝕流路)。高濃度的緩沖鹽會縮短密封墊和活塞的使用壽命，長時間使用0.1 mol或更高濃度的緩沖液時，必須用10 異丙醇溶液從泵的背面沖洗掉所有可能存在的結(jié)晶，從而保護柱塞桿和密封墊。用后的異丙醇經(jīng)0.45 μm(或0.22 μm)濾膜過濾后可反復使用 2 ～3 次［6－7］。

6)當泵的壓力上限超過6 000 psi時，應及時檢查和更換泵頭過濾白頭和保護柱芯。

1.2 排氣泡

1)當擰松快速清洗閥時不宜擰得過松，一般擰松2圈左右即可，擰得過松流動相容易從清洗閥部位流進泵頭中引起報警。

2)使用快速清洗閥時，只能一個一個通道地排氣泡，不得將幾個通道同時按比例排氣泡，因為比例閥的快速切換易導致?lián)p壞。

1.3 自動進樣器

建議用甲醇∶水=1∶1的溶液洗針，同時每天洗針前要檢查一下洗針瓶中是否有洗液(50 甲醇)。

1.4 樣品處理

測定的樣品或標樣在流動相中一定要易溶，否則進樣后會結(jié)晶造成定量不準確或堵塞色譜柱。最好使用流動相溶解樣品，樣品和標準溶液在進樣前必須用0.45 μm(或 0.22 μm)濾膜(有機膜或者水膜)過濾，除去微粒雜質(zhì);樣品中一般不得含有鹽類及強酸、強堿性等物質(zhì)?？梢允褂妙A處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)［8］。

1.5 色譜柱

使用自帶色譜柱，則應把換下的色譜柱用堵頭(無孔)及時密封。用完后需把實驗室原來的色譜柱安裝好。換柱必須在有流動相流出的情況下進行，以免空氣進入色譜柱。儀器長時間不用，每個泵通道和整個流路一定要用甲醇沖洗后保存，以免結(jié)晶或造成污染［9］。

1.6 檢測器

1)檢測器的紫外或可見燈在長期打開的情況下，一定要保證有溶液流經(jīng)檢測池。若不需要做樣，可設(shè)置一個較低的流速(如0.05 mL/min)或關(guān)閉燈的電源。

2)檢測器的燈一般要在流通池有溶液連續(xù)流動幾分鐘后才打開，如果流動池中有氣泡，則會提示漂移過大無法通過自檢和校正。

3)檢測器的氘燈或鎢燈不要經(jīng)常開關(guān)，每開關(guān)一次燈的壽命約損失30 h。若儀器經(jīng)常使用，可幾天開關(guān)燈一次。

4)清洗檢測池時可以在不接柱子的情況下，用100 異丙醇沖洗整個流路。如果還不行，同法用10 或5 的稀硝酸沖洗，大約45～60 min，最后用水沖干凈。

1.7 實驗結(jié)束

1)實驗完畢立即清理操作臺面，打掃室內(nèi)衛(wèi)生，拖干凈地面，關(guān)好門窗。

2)如實做好實驗登記。若機器出現(xiàn)異常，請勿擅自拆開機器，應及時通知儀器管理人員。使用液相色譜儀需提前預約，每次使用不準超過3 d，如繼續(xù)使用則應再次進行網(wǎng)上預約。

2 操作流程

2.1 開機步驟

1)打開計算機后自動彈開＜CAG Bootp server＞→菜單→通信成功。

2)打開色譜儀開關(guān)，進入在線工作站。(紅色:未就緒)

3)預熱30 min即可。(黃→未就緒，綠→已就緒，藍→采集數(shù)據(jù)，紅→報警)

4)設(shè)置泵。點擊＜泵＞＜檢測器＞開關(guān)，左鍵點擊＜泵＞→＜Solvent bottles＞→＜Solvent Bottles Fillng:Instrument 1＞設(shè)置每瓶中實際液體量、最低液體量及瓶容量。

5)排氣泡。若新?lián)Q流動相或長時間沒開機，應向左旋開排氣閥，逐個流動相瓶排氣泡，排氣時應逐漸升高流速(1～2 mL/min)，再逐漸降低流速。(1)在對話框中點擊相應瓶A、B、C、D圖標→＜Set up Pump… ＞。(2)出現(xiàn) ＜Set up Pump:Instrument 1＞→設(shè)置＜Flow＞流速為1.0和瓶B、C、D的百分比(例如:A為100、B為0、C為0、D為0)即排A內(nèi)的空氣){＜Pressure Limits＞(壓力)0～200之間;＜Timetable＞(設(shè)置梯度洗脫)。}(3)改變流速為1.5→OK!(當沒有氣泡即洗脫完畢，向右旋關(guān)閉排氣閥，最后將流速調(diào)至使用流速——大約1.0 mL/min。)依次排B、C、D的氣泡。

6)編輯檢測方法。(1)首先編輯方法前將排氣閥門關(guān)閉，將流速逐漸降至1.0 mL/min。(2)點擊＜Method＞→ ＜Edit Entire Method＞。(3)彈出對話框 ＜Edit Method:Instrument 1＞a方法信息;b參數(shù)設(shè)置(可設(shè)置流量、波長、溶劑配比);c數(shù)據(jù)分析、報告處理(一般不選);d運行時間表。(4)點擊＜OK＞進入＜Method Comments＞，可輸入實驗名稱，也可不選，在后面也會提示輸入。

7)參數(shù)設(shè)定。點擊＜OK＞進入?yún)?shù)設(shè)定(根據(jù)文獻或?qū)嶒灧椒ㄔO(shè)定)。(1)＜Control＞(流速):一般為1～2 mL/min。(2)＜Solvents＞(溶劑名稱及配比)。(3)＜Presswre Limits＞(壓力限)Max:300 bar(壓力保護限，默認);Min:0bar。(4)＜Timetable＞(洗脫梯度)一般為:一種溶劑配比遞增或遞減。(5)點 Display選擇顯示方式。(6)點＜OK＞→＜VWD Signal:Instrument 1＞(檢測器設(shè)置)對話框，＜Wavelength＞(波長)，＜Peakiwidth＞(檢測器響應時間):默認為＞0.1 min(2 s)。(7)點擊 ＜OK＞→ ＜Run Time Checklist:Instrument 1＞對話框，選中＜Data Aequistion＞和＜Standard Data Analysis＞。(8)點擊 ＜OK＞(存儲檢測方法):點＜Save Method as＞進入對話框，可輸入名稱和注釋，也可不輸，然后點＜OK＞結(jié)束方法存儲。

8)基線調(diào)節(jié)。(1)點擊界面左下角“三箭頭”顯示＜Online Plot＞對話框，觀察基線是否平穩(wěn)(波動在0.05個單位之間)＜Adjust＞(復位)，＜Balance＞(強制使基線歸零)。(2)點擊＜Change…＞(調(diào)節(jié)):基線走速(x軸)、吸收單位(y軸)、圖表顯示曲線數(shù)量，點＜OK＞結(jié)束進樣前設(shè)置。

9)樣品信息。(1)點擊＜Run Method＞(運行方法)→ ＜Simple Info… ＞ → ＜Sample info:instrument 1＞:＜Operator Name＞(操作者姓名)、＜Data File＞中選＜Manual File Name＞:(輸入文件名)(必須每次輸入新名，否則覆蓋前一次測試結(jié)果)，Subdirectory:(文件存儲名)，Simple Name:(樣品名)，Simple Amount:(進樣量)，點＜OK＞結(jié)束樣品信息輸入。

10)開始進樣。進樣量一般5～25 μL。(儀器配有自動進樣器)。

11)停止采樣。峰出完后按＜F8＞或者＜stop＞停止(也可在＜Run control＞下拉菜單中關(guān)閉)，自動出現(xiàn)圖表?？芍苯哟蛴?，也可進行峰型優(yōu)化后再打印。

12)峰優(yōu)化。打開＜offline＞(離線)，點擊＜File＞→＜Load signal＞調(diào)出文件(或者點擊界面圖標打開):(1)打開文件保存的所在位置。(2)點擊＜Graphics＞→＜Signal Options…＞可以進行優(yōu)化處理。(3)選擇＜Autoscale＞可以進行自動譜圖優(yōu)化。(4)點擊＜Interqration＞→＜Interqration Event…＞進行人為峰篩選。(5)設(shè)置峰高域和峰面積域進行峰的篩選。(6)退出峰優(yōu)化。

13)打印報告:(1)點擊＜Report＞→＜Specfy Report…＞進行打印格式和內(nèi)容設(shè)置。(2)選擇＜Printer＞為直接打印，選擇＜Screen＞為顯示到屏幕后再打印。選中＜File＞可選擇文件存儲格式(File Type)，一般為.TXT格式，其他項為打印內(nèi)容可選項。(3)點擊＜Report＞→＜Print Report＞打印報告［10］。

2.2 關(guān)機步驟

將手動進樣器扳手扳上去，拔出進樣器(自動進樣器除外);停止檢測器和泵，退出色譜工作站;關(guān)閉液相色譜儀電源，關(guān)閉計算機。

3 結(jié)束語

以上介紹了液相色譜儀的日常管理維護和操作流程。分析工作者在實際工作中要管理和使用好儀器，使用過程中必須對儀器進行認真觀察和仔細分析。只有合理地使用、維護和保養(yǎng)好儀器，在出現(xiàn)異常時認真分析產(chǎn)生異常的原因，對可能出現(xiàn)故障的部位作出正確的判斷和適當?shù)奶幚恚拍苁挂合嗌V儀更好地為實驗教學和科研提供服務(wù)［11－12］。

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