李苗云,惠利娜,趙改名,劉 杰,黃現青,高曉平

(河南農業(yè)大學食品科學技術學院,河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002)

金黃色葡萄球菌是引起細菌性食物中毒的重要病原菌之一[1]，肉、蛋、奶等動物性食品極易受其污染[2].當食品遭其污染而又在符合其生長所需的溫度、濕度、pH值和營養(yǎng)條件環(huán)境下時，細菌增值到一定數量所產生的腸毒素將引發(fā)食用者產生惡心、嘔吐和下痢等中毒癥狀，對食品安全造成了嚴重威脅.我國生鮮肉的消費量大，流通和運輸環(huán)節(jié)包裝簡單或者不包裝，增加了其在運輸、儲存以及消費過程中受到二次污染的機率.因此，金黃色葡萄球菌成為中國肉品檢測過程中重要的檢測項目之一.實時熒光定量PCR技術因其敏感度高、特異性強等優(yōu)點被廣泛應用到微生物的檢測中[3].金黃色葡萄球菌的nuc基因是金黃色葡萄球菌DNA片段高保守序列[4,5]，該基因編碼金葡菌耐熱核酸酶，具有特異性[6,7].國內外對此進行了大量的研究，蘇明權等[8]成功構建了金黃色葡萄球菌重組質粒標準品和金黃色葡萄球菌實時熒光定量PCR方法，該方法主要應用于臨床感染診斷及商品檢驗檢疫；張巧艷[9]研究了基于SYBR Green I熒光定量PCR快速檢測生乳及乳制品中的沙門氏菌.VINCENZINA等[10]研究發(fā)現，基于Tapman的方法比基于SYBR Green 的熒光定量PCR方法靈敏度低，SYBR Green熒光定量PCR能夠實現快速、準確、高通量的鑒別原料奶中金黃色葡萄球菌的腸毒素基因.而且HORSON[11]利用SYBR Green熒光定量PCR的方法檢測金黃色葡萄球菌的entA基因，指出SYBR Green方法具有操作簡單便捷、快速定量、比特異性序列染料標記的探針價格便宜等明顯優(yōu)勢.本試驗以生鮮豬肉為材料，建立金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR方法，與傳統(tǒng)平板計數法同時建立生鮮肉中金黃色葡萄球菌生長曲線，探討熒光定量PCR方法定量檢測生鮮肉中金黃色葡萄球菌的應用范圍.

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 試驗材料 生鮮豬肉(豬背最長肌).

1.1.2 菌株 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)ASI.1861、沙門氏菌(Salmonella) ASI.1859F3 由雙匯技術中心惠贈；大腸桿菌(Escherichiacoli)O157：H7 NCTC12900、單增李斯特菌(L.monocytogenes)ATCC54002、綠膿桿菌(P.aeruginosa)ATCC15442和乙型溶血性鏈球菌(Betahemolyticstreptococcus)32210-4a由河南省出入境檢驗檢疫局微生物實驗室惠贈.

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 主要試劑 BP培養(yǎng)基及添加劑(OXOID，英國)、細菌基因組DNA提取試劑盒(上海生物工程有限公司)、SYBRPremix Ex TaqTM PCR試劑盒(Takara公司)、Tris(北京賽博科技有限公司).根據GenBank中金黃色葡萄球菌特異性nuc基因序列以及相關文獻[6]報道的該基因序列，Gene ID:1120790，并使用Primer 5.0和Oligo 6軟件設計引物，上游引物：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′,下游引物:5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′，擴增長度279 bp，由Takara生物技術有限公司合成.

1.1.3.2 儀器 ABI 7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司；UVP凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；Biometra梯度PCR儀，德國Biometra公司；DYY-12型電泳儀，北京六一儀器廠；全自動螺旋接種儀，英國Don Whitley Scientific公司；全自動菌落分析儀，英國Synbiosis公司.

1.2方法

1.2.1 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.2.1.1 菌株培養(yǎng) 無菌操作，挑取營養(yǎng)瓊脂斜面金黃色葡萄球菌標準菌株接種到液體TSB-YE培養(yǎng)基中.37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜后待用.其他5株測試菌株接種到TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法同金黃色葡萄球菌.

1.2.1.2 模版DNA的提取 取1 mL菌液，10 000 r·min-1離心1 min，1×TE溶液清洗后，用上海生物工程細菌基因組DNA提取試劑盒，提取金黃葡萄球菌和其他5株測試菌株的基因組核酸.

1.2.1.3 實時熒光定量PCR方法的建立和優(yōu)化 參照Takara公司SYBR?Premix Ex TaqTM (RNaseH Plus)說明書進行，并對退火溫度和引物添加量進行優(yōu)化.

熒光定量PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，63 ℃退火34 s，共40個循環(huán).用溫度梯度PCR儀在59～65 ℃(溫度梯度PCR儀自動生成6個溫度點)PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.PCR擴增后，1.8%普通瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳條帶亮度初步選擇最佳退火溫度.同時結合相應的融解曲線，篩選出PCR反應的最佳退火溫度.

1.2.1.4 特異性試驗 對提取的所有細菌基因組DNA分別進行熒光定量PCR試驗，其中攜帶nuc基因的金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌株， 其他致病菌作為陰性菌株來檢驗引物的特異性.熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，63 ℃退火34 s，循環(huán)40次；在63 ℃退火34 s階段收集熒光值， 并在上述擴增條件后增加63 ℃至95 ℃的融解曲線分析步驟.

1.2.1.5 靈敏性試驗 將金黃色葡萄球菌的菌懸液用無菌生理鹽水進行10倍倍比稀釋，共做8個稀釋度，提取基因組核酸后進行熒光定量PCR擴增，得到明顯融解峰的最低濃度即為方法的檢出限.同時，分別將稀釋的菌液接種于BP培養(yǎng)基上，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)18～24 h，用菌落分析儀計數.

1.2.2 熒光定量PCR檢測生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌

1.2.2.1 樣品制備及接種 用無菌生理鹽水對培養(yǎng)的菌液進行稀釋，制成濃度約為103cfu·mL-1的菌懸液.同時，無菌條件下，去除豬背最長肌表面筋膜，將其分割成大小約25 cm2，厚約2～3 cm的組織塊，無菌操作取樣品于菌懸液中浸蘸15 s，濾網上靜置15～20 min后，用無菌托盤包裝，置于20 ℃生化培養(yǎng)箱中進行恒溫貯藏.

1.2.2.2 實時熒光定量PCR方法和平板計數方法對肉樣的檢測對比 每隔8 h按照GB 4789.2—2010方法處理樣品，用全自動螺旋接種儀接種菌懸液至BP平板上，平板至于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h，用菌落分析儀計數.同時，參照1.2.1方法對菌懸液提取DNA，進行熒光定量PCR方法檢測.用2種方法的數據進行對比分析.

1.3統(tǒng)計分析

生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌在20 ℃條件下的生長曲線數據采用Excel 2007進行統(tǒng)計分析.

2 結果與分析

2.1金黃色葡萄球菌熒光定量PCR檢測方法的建立

2.1.1 退火溫度的優(yōu)化結果 用梯度PCR儀對退火溫度進行(59～65 ℃)優(yōu)化，擴增產物EB染色后，1.8%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示.由圖1可知，PCR產物條帶在62.2～63.3 ℃最亮，擴增效率最高，由此初步確定退火溫度在63℃左右時較好，然后在熒光定量PCR儀上用標準菌DNA進行驗證(圖2).

由圖2可知，退火溫度設為63 ℃時，PCR反應曲線Ct值在15左右，融解溫度在79 ℃左右，熒光值的起跳幅度△Rn很顯著.由此可以確定退火溫度為63 ℃時，PCR擴增效率和特異性都很好，最終選定退火溫度為63 ℃.

M-Maker(DL2000)；1～6.退火溫度為59.3，60.2，61.2，62.2，63.3，64.2 ℃

M-Maker(DL2000)；1 to 6.annealing temperature :59.3，60.2，61.2，62.2，63.3，64.2 ℃

圖1退火溫度優(yōu)化結果

Fig.1Theresultsofoptimizingtheannealingtemperature

A.擴增曲線；B.對應的融解曲線1.退火溫度63 ℃; 2.陰性對照

2.1.2 引物濃度的優(yōu)化結果 由圖3可知，隨著引物添加量的減少，擴增曲線的Ct值逐漸變大，引物量越高，擴增效率越高.當引物添加1 μL時，其Ct值明顯小于2 μL和3 μL(圖3-A)，但引物添加量為3 μL時陰性對照出現了引物二聚體(圖3-B)，特異性降低.引物添加2 μL時Ct值和3 μL相比并不大，且特異性良好.綜合分析確定最佳引物添加量為2 μL.

2.1.3 特異性結果 由圖4可知，陽性標準菌株金黃色葡萄球菌和其他致病菌菌株進行熒光定量PCR擴增，僅金黃色葡萄球菌檢測到熒光信號，特異性融解曲線Tm為80 ℃左右，符合融解曲線通常呈現單一峰形的要求[12].其他5株測試菌和陰性對照均為一平直的線，Ct值無法讀取，檢測結果均為陰性.沒有引物二聚體引起的假陽性擴增信號，說明反應體系的特異性強.

2.1.4 靈敏度試驗結果 由圖5可知，當金黃色葡萄球菌的濃度在2.17×108～2.17×101cfu·mL-1范圍時，均有擴增信號出現，當金黃色葡萄球菌梯度稀釋至21.7 cfu·mL-1時仍有明顯的融解峰.因此該方法的靈敏度為21.7 cfu·mL-1.這與HORSMON[11]報道的檢測限在同一水平.同時制備如圖6所示的熒光定量PCR標準曲線，在102～108cfu·mL-1范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.989.

2.2熒光定量PCR在生鮮豬肉金黃色葡萄球菌中的應用

用平板計數方法和熒光定量PCR方法對20 ℃溫度條件下生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌的生長特性進行研究發(fā)現，2種方法均能形成典型的“S”型生長曲線(圖7).將2種結果進行對比，發(fā)現微生物初始數量為2.56 log(cfu·g-1)，在18 h內2種方法的檢測結果重合，為3.12 log(cfu·g-1)，在24 h以后進入穩(wěn)定期，熒光定量PCR檢測結果逐漸高于平板計數結果，終點值分別為5.11 log(cfu·g-1)，6.64 log(cfu·g-1).當金黃色葡萄球菌繁殖達到最高點進入穩(wěn)定期和衰亡期，由于豬肉中的蛋白質、脂肪和碳水化合物等營養(yǎng)物質，被逐步分解成一系列的產物如胺、吲哚、硫醇、硫化氫、脂肪酸、甘油、醛、酮等化合物以及各種有機酸，或同時產生醇和CO2氣體等[13].豬肉表面有害代謝產物積聚、pH逐漸下降，金黃色葡萄球菌繁殖速度減慢，細胞活性變低，死亡菌數逐漸增加，導致BP平板計數結果在穩(wěn)定期以后呈現緩慢下降的趨勢.但是有研究表明即使在細胞凋亡之后，DNA也不會迅速裂解，在細胞凋亡8 h之后幾乎不能觀察到DNA裂解，24 h以后DNA裂解才明顯[14].因此，DNA的裂解相對于細胞凋亡有一定的滯后性，這可能是在進行熒光定量PCR檢測時，其檢測細菌數量明顯高于平板計數方法的原因.

A.擴增曲線；B.對應的融解曲線 A.The amplification curve；B.Melting curve

A.擴增曲線；B,對應的融解曲線; 1-3.金黃色葡萄球菌；4.沙門氏菌；5.乙型溶血性鏈球菌； 6.大腸桿菌O157：H7；7.單增李斯特菌；8.綠膿桿菌；9.陰性對照.

A. The amplification curve；B.Melting curve; 1-3.Staphyloccocusaureus; 4.Salmonella; 5.Betahemolyticstreptococcus; 6.EscherichiacoliO157：H7; 7.L.monocytogenes; 8. P.aeruginos; 9. negative control

圖4熒光定量PCR特異性試驗

Fig.4Specifictestofthereal-timePCR

1.均質液中提取的模板DNA；2～8.均質液10倍梯度稀釋后提取的模板DNA；9.陰性對照

圖6 標準曲線

圖7 熒光定量PCR與平板計數檢測方法建立的20 ℃條件下金黃色葡萄球菌生長曲線

以BP平板和分離鑒定為主的傳統(tǒng)檢測金黃色葡萄球菌的方法有很多弊端，傳統(tǒng)方法費時費力，需要長達6 d的準備時間[15]，WILSON等[16]研究指出傳統(tǒng)方法不適用于進行大批量的金黃色葡萄球菌的種群鑒定.大量生鮮肉的貯藏試驗表明[17,18]，低溫條件下，生鮮肉腐敗時，微生物的生長處于對數末期或穩(wěn)定前期；高溫條件下，生鮮肉腐敗時，微生物一般處于對數期.因此，在生鮮肉的正常貨架期內，微生物的生長均未達到穩(wěn)定期.由此可知，在生鮮肉的貨架期內，可以用熒光定量PCR方法對微生物進行定量檢測，為了避免檢測的肉樣中菌量較少提取不出模版DNA的問題出現，可適當增加富集培養(yǎng)步驟，保證檢測的準確性.熒光定量PCR的方法與傳統(tǒng)方法相比，無須分離鑒定，可有效縮短檢測時間，提高檢測效率.因此，本研究建立的熒光定量PCR的方法，能夠對貨架期內生鮮肉中金黃色葡萄球菌進行高效定量檢測.同時，該方法為生鮮肉中其他致病、致腐微生物的檢測提供了理論依據.

3 結論

本研究優(yōu)化并建立了檢測金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR的反應體系，為：2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上、下游引物(1 μmol)各2.0 μL，模板為2.0 μL，水4 μL共20 μL；反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，63 ℃退火34 s，共40個循環(huán).應用此方法建立生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌在20 ℃條件下的生長曲線與傳統(tǒng)平板方法的結果對比發(fā)現，在生鮮豬肉的貨架期內，熒光定量PCR檢測技術能夠對金黃色葡萄球菌高效進行定量檢測.

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