廖春麗， 吳創(chuàng)業(yè)， 鄭 瑞， 孫寧聰， 鞠慧麗， 胡繼勇， 單林娜

(1.河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467044； 2.平頂山質(zhì)量工程學(xué)院食品與化工系，河南 平頂山 467044； 3.河南城建學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，河南 平頂山 467044)

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 藥用植物 9種藥用植物分別選用重樓(ParispolyphyllaSmith var.chinensis (Franch.) )、薄荷(MenthahaplocalyxBrig.) 、獨(dú)活(RadixAngelicaepubescentis.) 、扁蓄(PolygonumaviculareL.)、山豆根(SophoratonkinensisGapnep.)、黃連(CoptischinensisFranch.)、澤瀉(Alismaorientalis(Sam.) Juzep.)、柴胡(BupleurumchinensDC.)、川椒(Zanthoxylumbungeanum.)的藥用部位的干品，材料來源于平頂山市區(qū)國大藥房中藥店.

1.1.2 藻種 藻種選用小球藻，銅綠微囊藻，惠氏微囊藻.這些藻種來自中科院水生生物研究所藻種保藏中心.藻種經(jīng)活化后，在25 ℃、光照強(qiáng)度為2 500 lx、光暗期為12 h∶12 h的條件下培養(yǎng).藻種的接種及傳代過程均嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)則進(jìn)行.藻類培養(yǎng)基：綠藻使用SE培養(yǎng)基[9]；藍(lán)藻使用BG11培養(yǎng)基[10].

1.2方法

1.2.1 藥用植物浸提液的制備 分別稱取上述藥用植物干品2 g，加入50 mL 蒸餾水，100 ℃水浴1 h，最后過濾定容至50 mL，其藥用植物浸提液質(zhì)量密度為4 g·L-1.

1.2.2 藥用植物對藻的溶藻效果的測定 將藥用植物浸提液按1∶5的接種量投入到對數(shù)生長期的惠氏微囊藻、小球藻和銅綠微囊藻的藻液中(藻的密度控制為106個(gè)·mL-1)，培養(yǎng)條件與藻的相同，設(shè)置對照和加藥用植物樣各3組平行.加藥用植物溶藻5 d后測定藻細(xì)胞密度，計(jì)算出不同藥用植物對不同藻的溶藻率.根據(jù)下面的公式計(jì)算出藥用植物的溶藻率：

R=(1-N/N0)×100%

式中：R為藻細(xì)胞抑制率( %) ;N為處理組藻細(xì)胞密度(個(gè)·mL-1) ;N0為對照組藻細(xì)胞密度(個(gè)·mL-1)

1.2.3 粗酶液的制備 將藥用植物浸提液按體積比1∶5的接種量投入到對數(shù)生長期的藻液中(藻的濃度控制為106個(gè)·mL-1)，培養(yǎng)條件與藻的相同.設(shè)置對照和加藥用植物樣各3組平行，加藥用植物溶藻后,每天取1次樣，連續(xù)取樣5 d，取溶藻樣3 000 r·min-1離心5 min,然后把離心過的藻細(xì)胞分別加預(yù)冷至4 ℃的0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液(提取SOD，CAT，POD的磷酸緩沖液pH值分別為7.8,7.0,5.5)和少量石英砂在 0～4 ℃冰浴中研磨，勻漿液7 000 r·min-1離心10 min,取上清液即粗酶液測定酶活性.

1.2.4 各種酶活性的測定 超氧化物歧化酶(SOD)∶3 mL反應(yīng)體系包括: 30 mL 50 mmol·L-1的 pH值7.8磷酸緩沖液,依次溶入Met，NBT，核黃素與EDTA，使它們的濃度分別為1.3×10-2mol·L-1,6.3×10-5mol·L-1,1.3×10-6mol·L-1與1×10-4mol·L-1.試驗(yàn)組加入上述3 mL反應(yīng)體系和30 μL粗酶液(用未加粗酶液的反應(yīng)體系做對照)，在25～30 ℃下用光強(qiáng)4 000 lx的熒光燈管(可用15 W熒光燈)進(jìn)行光照，15～20 min后，出現(xiàn)顏色變化，停止光照，在560 nm測定吸光度值.過氧化物酶: 反應(yīng)體系為: 50 mL 50 mmol·L-1的 pH值5.5磷酸緩沖液,加入28 μL愈創(chuàng)木酚，愈創(chuàng)木酚溶解冷卻后加入19 μL 30% H2O2.試驗(yàn)組加入上述3 mL反應(yīng)體系和1 mL粗酶液(對照組加入上述3 mL反應(yīng)體系和1 mL 50 mmol·L-1的 pH值5.5磷酸緩沖液),反應(yīng)由加入啟動(dòng),25 ℃下測定470 nm吸光度值，把取的樣每隔1 min讀數(shù)1次，3 min內(nèi)吸光度值變化為1個(gè)計(jì)算單位.過氧化氫酶采用碘量法測定[11].

2 結(jié)果與分析

2.1各種藥用植物浸提液的除藻效果

在無菌條件下，分別將9種藥用植物浸提液按1∶5的接種量投入到對數(shù)生長期的藻液中(藻的密度控制為106個(gè)· mL-1)，置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)上述藥用植物浸提液的質(zhì)量濃度均為4 g·L-1.對藥用植物重樓、川椒、薄荷、獨(dú)活、扁蓄、山豆根、黃連、澤瀉、柴胡進(jìn)行初步的抑藻篩選試驗(yàn)(圖1)

從圖1的除藻效果來看，重樓和黃連這2種藥用植物浸提液對銅綠微囊藻、惠氏微囊藻、小球藻的除藻效果較好.重樓浸提液對3種藻除藻率分別達(dá)到了78%，70%，60%；黃連浸提液對3種藻除藻率分別達(dá)到了75%，75%，63%.從這些數(shù)據(jù)中又看出，重樓浸提液對惠氏微囊藻的除藻效果最好，黃連浸提液對銅綠微囊藻，惠氏微囊藻的除藻效果最好.然后以銅綠微囊藻和惠氏微囊藻為研究對象，研究重樓和黃連這2種藥用植物浸提液對它們的抗氧化體系酶活性的影響.

圖1 各種藥用植物浸提液的除藻效果

2.2藥用植物浸提液對藻類SOD活性的影響

考慮到單位體積培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞數(shù)不同,因此將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻類計(jì)數(shù),計(jì)算出單位藻細(xì)胞的SOD活性,以△A470(min·106cells)-1表示.圖2和圖3顯示出藥用植物浸提液(重樓和黃連)對銅綠微囊藻和惠氏微囊藻超氧化物歧化酶活性的影響.對照組隨著時(shí)間的延長，銅綠微囊藻和惠氏微囊藻的SOD活性逐漸增加；試驗(yàn)組，剛開始時(shí)重樓和黃連藥用植物浸提液都對2種藻的超氧化物歧化酶活性有促進(jìn)作用,但隨著作用時(shí)間的延長,銅綠微囊藻和惠氏微囊藻的SOD活性逐漸降低.而且試驗(yàn)組超氧化物歧化酶的活性都低于對照組的活性，這就說明了超氧化物歧化酶SOD不能及時(shí)消除過量的氧自由基，這些增加的自由基會(huì)氧化細(xì)胞膜等膜質(zhì)結(jié)構(gòu)，破壞藻細(xì)胞的正常生長與繁殖，進(jìn)而印證了重樓和黃連藥用植物浸提液對銅綠微囊藻和惠氏微囊藻有溶解作用.

圖2 重樓浸提液對藻SOD活性的影響

圖3 黃連浸提液對藻SOD活性的影響

2.3藥用植物浸提液對藻類CAT活性的影響

圖4和圖5顯示出藥用植物浸提液(重樓和黃連)對銅綠微囊藻和惠氏微囊藻過氧化氫酶活性的影響.本研究以被分解的H2O2量中，空白滴定值減去樣品滴定值差為縱坐標(biāo)，以作用時(shí)間為橫坐標(biāo).可以看出隨著時(shí)間的延長，銅綠微囊藻和惠氏微囊藻的SOD活性逐漸降低.

2.4藥用植物浸提液對藻類POD活性的影響

黃連和重樓浸提液中的化感物質(zhì)對2種藻的過氧化物酶(POD)的影響規(guī)律與其對SOD、CAT的影響規(guī)律相類似.圖6和圖7可以看出，隨著時(shí)間的延長，銅綠微囊藻和惠氏微囊藻的SOD活性逐漸降低.

圖4 重樓浸提液對藻CAT活性的影響

圖5 黃連浸提液對藻CAT活性的影響

圖6 黃連浸提液對藻POD活性的影響

圖7 重樓浸提液對藻POD活性的影響

3 結(jié)論與討論

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