王風(fēng)芹， 李傳斌， 張 瑞， 張雷鳴， 謝 慧， 宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

隨著我國(guó)畜牧業(yè)的持續(xù)高速發(fā)展，飼料需求量不斷增加，其中蛋白質(zhì)飼料更是重中之重.玉米秸稈是草食家畜主要的飼料來(lái)源，但秸稈粗纖維含量高，蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和可溶性碳水化合物含量低，畜禽消化率低，適口性差，直接用于養(yǎng)殖業(yè)效率極低[1,2].因此，以玉米秸稈為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料受到人們的廣泛關(guān)注[3～7].異Vc鈉是目前食品工業(yè)上廣泛使用的抗氧、防腐、保鮮劑[8]，在其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量生產(chǎn)廢液，如鄭州市某生物化工廠年產(chǎn)異Vc 鈉3 000 t，對(duì)廢水進(jìn)行達(dá)標(biāo)處理后，每天仍有10余t高濃度制藥廢水的濃縮液剩余[9].該生產(chǎn)廢液是一種棕黑色、富含大量有機(jī)質(zhì)、高鹽、粘稠的酸性液體(pH值4.1～4.6)[10]，若能對(duì)其進(jìn)行資源化利用，不僅可以減輕環(huán)境壓力，還可提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值.本研究首先對(duì)分離得到的耐高濃度異Vc鈉生產(chǎn)廢液(Waste Water of Sodium Erythorbat Production,WEP)中的菌株進(jìn)行鑒定，并利用該菌株和白地霉對(duì)玉米秸稈復(fù)合WEP進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料，以期提高玉米秸稈和WEP的利用價(jià)值.

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 玉米秸稈 風(fēng)干并粉碎至40目備用.其組成成分如下：纖維素32.30%，半纖維素18.81%，木質(zhì)素14.56%，真蛋白4.34%，粗蛋白5.35%.

1.2菌種

白地霉(Geotrichumcandidum)，由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存.

1.3培養(yǎng)基

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 5 g玉米秸稈，1 g麩皮，固液比1∶4(液體使用15% WEP，即將WEP稀釋至原液含量為15%，并在稀釋液中添加5 g·L-1硫酸銨，5 g·L-1磷酸二氫鉀，1 g·L-1的硫酸鎂，pH值調(diào)至4.5)，混合均勻后于121 ℃滅菌15 min.

1.3.2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏0.3 g、蛋白胨0.5 g、NaCl 0.5 g、瓊脂2 g、水100 mL，調(diào)pH值7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min.

1.3.3 PDA培養(yǎng)基 去皮馬鈴薯20 g，加水煮沸30 min，過(guò)濾取汁，加葡萄糖2 g，蒸餾水定容至100 mL，瓊脂2%，121 ℃滅菌15 min.

1.3.4 麩皮浸汁種子液 10%的麩皮浸汁，2%的葡萄糖，121 ℃滅菌15 min.

1.4耐高鹽菌株的分離與鑒定

1.4.1 富集培養(yǎng)與分離 配制10%～20% WEP固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成同1.3，其中所用WEP稀釋液中原液含量為10%～20%)，不滅菌，于28 ℃下培養(yǎng)2 d，挑取生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌在牛肉膏蛋白胨或PDA固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配制時(shí)所用液體為相應(yīng)濃度的WEP稀釋液，不加無(wú)機(jī)鹽，見(jiàn)1.3)上反復(fù)劃線分離，直至得到單菌落.取培養(yǎng)2 d的牛肉膏蛋白胨(細(xì)菌)或PDA(真菌)斜面菌種，加入5 mL無(wú)菌生理鹽水制取菌懸液或孢子懸液，接種0.5 mL到固體發(fā)酵培養(yǎng)基(見(jiàn)1.3)中，攪拌均勻，于28 ℃發(fā)酵2 d，60 ℃烘干，測(cè)定真蛋白含量.

1.4.2 菌種鑒定

1.4.2.1 形態(tài)鑒定 接種供試菌株于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察菌落形態(tài)，利用水浸片法于普通光學(xué)顯微鏡下觀察孢子著生情況及其形態(tài)，對(duì)比《真菌鑒定手冊(cè)》[11]初步確定其分類(lèi)地位.

1.4.2.2 生理生化鑒定 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12].

1.4.2.3 系統(tǒng)發(fā)育研究 將供試菌株接種入PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r·min-1培養(yǎng)24 h后用無(wú)菌紗布過(guò)濾，并用無(wú)菌水沖洗3～5次，擠干水分.稱(chēng)取0.5 g菌絲于無(wú)菌研缽中，采用CTAB法進(jìn)行DNA提取[13].18S rDNA基因PCR擴(kuò)增的正向引物序列為：’-GATCCTGC CAGTAGTCA TATG-3’；反向游引物序列為：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’，由上海生物工程有限公司合成.PCR反應(yīng)體系為：Reaction Buffer(10×)5.0 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)4.0 μL，正向引物(10 μmol·L-1)2.0 μL，反向引物(10 μmol·L-1)2.0 μL，Taq聚合酶(5 U·μL-1)0.5 μL， DNA 50 ng，超純水補(bǔ)至50.0 μL，dNTPs及Taq聚合酶均購(gòu)自天根生化有限公司.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，5 min；94 ℃，30 s，52.8 ℃，45 s，72 ℃，50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min.1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，后送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序.將測(cè)序所得序列及GeneBank中獲得的參比菌株的相應(yīng)基因序列經(jīng)ClustalX序列比對(duì)后，采用TREECONW中的鄰接法(Neighbor-joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，自展值(bootstrap)為1000.

1.5供試菌株和白地霉混菌固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)

從馬鈴薯瓊脂斜面上挑一環(huán)孢子到裝有50 mL麩皮浸汁種子液的300 mL錐形瓶中，28 ℃、140 r·min-1培養(yǎng)24 h作種子液，接種0.5 mL種子液(白地霉∶Z2=1∶1)到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，28 ℃發(fā)酵2 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵物料中的真蛋白含量.為了確定混菌固態(tài)發(fā)酵工藝的相關(guān)參數(shù)，選擇發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、固液比、硫酸銨含量和初始pH值進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)，各處理設(shè)置3個(gè)重復(fù).試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1.

表1 混菌固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)因素和水平表

1.6測(cè)定方法

1.6.1 蛋白含量測(cè)定 稱(chēng)取一定量于60 ℃烘干至恒重，取0.5 g烘干樣品用10%三氯乙酸浸泡15 min以沉淀蛋白質(zhì)，定性濾紙過(guò)濾，去離子水洗3～4次，70 ℃烘干，按常量凱氏定氮法測(cè)定真蛋白含量[14～16]，粗蛋白含量直接采用凱氏定氮法測(cè)定.

1.6.2 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測(cè)定 采用萬(wàn)良玉改良法測(cè)定[17]，降解率D=(X0-X)/X0×100%，其中，X0指未發(fā)酵物料經(jīng)烘干后纖維素或半纖維素含量，X指物料經(jīng)發(fā)酵并烘干后纖維素或半纖維素含量.

1.6.3 還原糖的測(cè)定 取約0.5 g 60 ℃烘干的發(fā)酵料，用100 mL蒸餾水?dāng)嚢?、浸?0 min，定量濾紙過(guò)濾，取濾液采用DNS比色法[18]測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度A，樣品中還原糖含量計(jì)算公式：樣品中還原糖含量(mg·g-1)=100×A/w，其中：A為濾液還原糖質(zhì)量濃度(mg·L-1)；w為樣品質(zhì)量(g).

1.7數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1耐WEP菌株的分離

在28 ℃自然培養(yǎng)2 d的15%WEP固體發(fā)酵料上有微生物旺盛生長(zhǎng)，采用稀釋平板分離法分離優(yōu)勢(shì)菌種，并經(jīng)多次分離純化得到1株真菌，命名為Z2.利用該菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，28 ℃發(fā)酵2 d后發(fā)酵物料中真蛋白含量為5.90%，比對(duì)照(未發(fā)酵培養(yǎng)料)提高19.7%，表明該菌株不僅耐受15%的WEP，還可以顯著提高發(fā)酵物料中的蛋白質(zhì)含量.

2.2菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 Z2菌株的菌落為白色絨毛狀，質(zhì)地疏松，生長(zhǎng)迅速，28 ℃、48 h可長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板，但37 ℃不生長(zhǎng)；孢囊梗單生，孢子囊為洋梨形，多孢子，不彈射；孢囊孢子為卵形，呈灰褐色(圖1).根據(jù)其形態(tài)特征對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》[11]認(rèn)定Z2應(yīng)屬于毛霉目，毛霉科.該菌株可以利用蔗糖、木糖、乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、淀粉等為唯一碳源，但不能利用微晶纖維素.

A. 菌落；B. 孢子囊；C. 孢子釋放；D. 孢子(×400)

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育地位確定 對(duì)Z2菌株的18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定，得到長(zhǎng)度為2 135 bp的18S rDNA部分基因序列.對(duì)Z2菌株及其相關(guān)參比菌株的18S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，由圖2可以看出Z2菌株屬于毛霉目、毛霉科、犁頭霉屬，與傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)NRRL28639和Absidiaidahoensisvar.ThermophilaFSU6197位于同一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支，同源性分別達(dá)到99%和98%.因此將Z2菌株歸為犁頭霉屬(Absidia).

圖2 Z2菌株與相關(guān)參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3Z2和白地霉混菌固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

白地霉菌體蛋白質(zhì)含量高，且能產(chǎn)生獨(dú)特的芳香氣味，是飼料發(fā)酵中的常用菌種，本研究采用Z2和白地霉進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵.通過(guò)正交試驗(yàn)研究了固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、固液比(C)、硫酸銨含量(D)和初始pH值(E)對(duì)發(fā)酵物料中蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表2和表3.對(duì)發(fā)酵物料中真蛋白含量影響最大的是發(fā)酵時(shí)間，其次是溫度和固液比，初始pH值影響最小，最優(yōu)組合為：A2B2D4C2E3，即發(fā)酵溫度28 ℃，硫酸銨添加量1 g·L-1，固液比1∶4，初始pH值為5.5，發(fā)酵4 d.該組合不是正交試驗(yàn)中的已有組合，因此對(duì)該最優(yōu)組合進(jìn)行了發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4.在此條件下，發(fā)酵后真蛋白含量達(dá)62.5 mg·g-1，比對(duì)照提高了26.01%，且高于正交試驗(yàn)中所有試驗(yàn)組；粗蛋白含量為101.2 mg·g-1，比對(duì)照提高了22.96%.物料經(jīng)Z2和白地霉混菌固態(tài)發(fā)酵后的物理狀態(tài)見(jiàn)圖3，濕料內(nèi)外都有大量的白色菌絲，并伴有醇香味.60 ℃烘干后，表面呈黃褐色，有干香味.

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析表

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

表4 正交試驗(yàn)優(yōu)化條件的發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果

A.濕料； B.干料

2.4發(fā)酵物料關(guān)鍵組分變化分析

2.4.1 真蛋白和還原糖含量變化趨勢(shì) Z2和白地霉在最優(yōu)發(fā)酵條件下混菌發(fā)酵，每隔12 h取樣1次，60 ℃烘干，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)品的還原糖和真蛋白含量，發(fā)酵過(guò)程中二者均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(圖4)，分別在發(fā)酵的60 h和96 h達(dá)到最大值341.5 mg·g和62.5 mg·g-1，其中真蛋白含量比發(fā)酵前提高了26.01%.

圖4 發(fā)酵過(guò)程中還原糖和真蛋白含量的變化趨勢(shì)

2.4.2 木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量測(cè)定 為考察發(fā)酵前后發(fā)酵物料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素成分的變化，對(duì)發(fā)酵前(0 h)和發(fā)酵后(96 h)物料中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5.混菌固態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵料中纖維素、半纖維素的降解率分別為11.20%和8.57%，但木質(zhì)素的降解率僅為0.73%.

表5 發(fā)酵前后發(fā)酵料中相關(guān)成分的變化

3 結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

1)耐WEP菌株的分離及鑒定：獲得1株能在15%WEP中旺盛生長(zhǎng)的犁頭霉菌株Z2，玉米秸稈和WEP混合物經(jīng)該菌株發(fā)酵后，真蛋白含量為59.0 mg·g-1，提高了19.7%.

2)Z2和白地霉混菌固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化：秸稈∶麩皮=5∶1，固∶液(15% WEP，添加1 g·L-1硫酸銨，0.5 g·L-1磷酸二氫鉀，0.1 g·L-1的硫酸鎂)=1∶4，初始pH值5.5，28 ℃，發(fā)酵4 d.在此條件下發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量為62.5 mg·g-1，粗蛋白含量為101.2 mg·g-1，分別比對(duì)照提高26%和22.96%.

3)發(fā)酵產(chǎn)品特性：玉米秸稈經(jīng)發(fā)酵后纖維素和半纖維素均得到了適度降解，提高了其作為飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和可消化性.

3.2討論

本研究以異Vc生產(chǎn)廢液復(fù)合玉米秸稈為原料發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白飼料，提出了異Vc鈉生產(chǎn)廢液資源化利用的新途徑.但由于異Vc鈉生產(chǎn)廢液中無(wú)機(jī)鹽含量較高，不利于微生物的生長(zhǎng)與發(fā)酵.通過(guò)富集培養(yǎng)、分離篩選得到1株犁頭霉菌株Z2，該菌株能夠在15%的WEP培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)，其中含有1.4%的Na+，相當(dāng)于3.54%的NaCl.通過(guò)條件優(yōu)化，利用白地霉和Z2菌株混菌發(fā)酵WEP和玉米秸稈后發(fā)酵物料中真蛋白含量為62.5 mg·g-1，粗蛋白含量為101.2 mg·g-1，比對(duì)照分別提高了26.0%和22.96%，纖維素和半纖維素降解率分別為11.20%和8.57%，提高了玉米秸稈作為飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和可消化性，發(fā)酵后的產(chǎn)品色、香、味較好，對(duì)提高動(dòng)物的采食量很有益處.據(jù)測(cè)算，發(fā)酵料中灰分含量約為180～200 mg·g-1，Na含量約為50～60 mg·g-1，Cl含量為4 mg·g-1，因此高灰分、高鹽含量是該發(fā)酵產(chǎn)品的局限，作為飼料使用時(shí)應(yīng)與其它飼料進(jìn)行適當(dāng)?shù)膹?fù)配，或發(fā)酵時(shí)減少WEP的使用量以降低發(fā)酵產(chǎn)品中灰分和鹽含量.

參考文獻(xiàn)：

[1]岳建芝,張 杰,徐桂轉(zhuǎn),等.玉米秸稈主要成分及熱值的測(cè)定與分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(9):30-32.

[2]邢廷銑.農(nóng)作物秸稈三級(jí)飼料化利用技術(shù)的概念和應(yīng)用[J].糧食與飼料工業(yè),1999(1):31-32.

[3]JWANNY E W,RASHAD M M,ABDU H M. Solid-state fermentation of agricultural waste into food throughPleurotuscultivation[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,1995,50(1): 71-78.

[4]陳金鐘,鄔蘇煥,宋興福.泔腳與秸桿混合發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白飼料的新工藝流程[J].上海環(huán)境科學(xué),2003,22(12): 998-1000.

[5]張偉心,馬艷玲,霍玉鵬.混合菌發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)菌體蛋白飼料的研究[J].飼料研究,2000(6):5-7.

[6]劉劍虹,陳慶森,陳劍勇,等.酸處理玉米秸稈生物轉(zhuǎn)化單細(xì)胞蛋白的研究[J].天津商學(xué)院學(xué)報(bào),2001,21(3): 1-5.

[7]GAO P J,QU Y B,ZHAO X,et al. Screening microbial strain for improving the nutritional value of wheat and corn straws as animal feed [J]. Enzyme and Microbial Technology,1997,20(8): 581-584.

[8]顧立新,王元春,王健祥.異維生素C鈉一步法合成工藝研究[J].化學(xué)世界,1999(5):251-253.

[9]潘 峰,時(shí) 蕾,劉鯤鵬. 異Vc 鈉制藥廢渣、濃殘液實(shí)驗(yàn)分析與綜合利用探討[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2009,37(5): 94-96.

[10]張雷鳴,萬(wàn)續(xù)良,王風(fēng)芹,等.玉米淀粉糖蜜殘夜的資源化利用探討[J].食品工業(yè)科技,2010,31(5):374-376.

[11]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979.

[12]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京:科學(xué)出版社,2001:349-398.

[13]GUO L D,HYDE K D,LIEW E C Y. Identification of endophytic fungi fromLivistonachinensisbased on morphology and rDNA sequences[J]. New Phytologist,2000,147: 617- 630.

[14]嚴(yán)永忠.改進(jìn)粗蛋白測(cè)定方法的探討[J].湖南飼料,2004(4):29.

[15]馬 丹.凱氏定氮法測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量[J].計(jì)量與測(cè)試技術(shù),2008,35(6):57-58.

[16]周?chē)?guó)順.飼料真蛋白的定量檢測(cè)[J].中國(guó)飼料,1996(7):33.

[17]宋安東.生物質(zhì)(秸稈)纖維燃料乙醇生產(chǎn)工藝試驗(yàn)研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

[18]董曉燕.生物化學(xué)試驗(yàn)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003.