拜廷陽(yáng)，趙德明，吳志明，閆若潛，劉淑敏，趙明軍,劉梅芬

巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)是一類(lèi)在自然界普遍存在而又有嚴(yán)格種屬特異性的病毒，屬β皰疹病毒亞科，致豬發(fā)病的為豬巨細(xì)胞病毒(Porcine Cytomegalovirus，PCMV)，是一種條件性傳染病。該病毒首次從英格蘭分離，是繼偽狂犬病毒之后發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)豬皰疹病毒[1]。患豬特征性臨診癥狀為食欲廢絕，母豬繁殖障礙，表現(xiàn)為流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎、產(chǎn)弱仔等；仔豬有明顯的眼炎、鼻炎和肺炎癥狀，生長(zhǎng)發(fā)育不良，增重差。本病毒分布廣泛，大多數(shù)常規(guī)條件下飼養(yǎng)的豬群均存在PCMV感染，而且抗體陽(yáng)性率都很高，但一般為亞臨床型。自從1955年Done首次報(bào)道該病以來(lái)，在英國(guó)、日本、德國(guó)、美國(guó)和澳大利亞等地區(qū)豬群的血清抗體陽(yáng)性率大于90%。在感染豬群中，血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)98%；近年來(lái)，豬群中PCMV感染呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且多與豬藍(lán)耳病等混合感染，大大加劇患豬的病死率[2]。在日本1972年就有本病病理學(xué)方面的報(bào)道[3]。隨著器管移植技術(shù)的發(fā)展，PCMV作為豬源病毒，對(duì)異種移植構(gòu)成的潛在威脅也引起了相應(yīng)重視[4-6]。

建立PCMV的快速診斷對(duì)該病的早期診斷、防治及公共衛(wèi)生等具有重要的意義。傳統(tǒng)的病毒分離方法需進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)增殖并觀(guān)察細(xì)胞病變，但由于PCMV在體外增殖較困難，所需時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以推廣應(yīng)用。因此建立豬巨細(xì)胞病毒快速、敏感、定量、特異的診斷方法非常必要。迄今為至，尚無(wú)利用FQ-PCR檢測(cè)PCMV感染的相關(guān)報(bào)道。特對(duì)建立PCMV TaqMan FQ-PCR檢測(cè)進(jìn)行試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 KingFisher全自動(dòng)核酸提取儀為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；ABI 7000熒光定量PCR 儀為美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)公司產(chǎn)品；梯度PCR儀為德國(guó)Biometra公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)(UV-2450)為日本島冿公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)為美國(guó)Alpha Innotech公司產(chǎn)品。DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購(gòu)自大連(寶)生物工程有限公司；磁珠法核酸全自動(dòng)提取試劑盒購(gòu)自Ambion生物科技公司；pGEM-T Easy載體購(gòu)自Promega公司 。

1.2質(zhì)粒、菌毒株及檢測(cè)樣品 重組質(zhì)粒pGEM-T/PCMV由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV) 、豬偽狂犬病毒(PRV)、高致病性豬藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV)、豬鏈球菌(SS)由河南省動(dòng)物疫病防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。ST 傳代細(xì)胞源豬瘟(CSFV)活疫苗毒株為產(chǎn)品。檢測(cè)樣品采自河南省部分豬場(chǎng)，診斷為臨床疑似PCMV感染后采集的15份病死豬扁桃體樣品，樣品加入適量PBS液勻漿后離心提取上清液和PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV的培養(yǎng)液態(tài)樣品，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[7]利用Kingfisher全自動(dòng)核酸提取儀、采用磁珠法進(jìn)行DNA和RNA的提取。

1.3引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中DNA聚合酶基因保守序列，利用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物對(duì)P1/P2(P1：5′-TGG CAC TGA TAC TTG ACA AGC -3′/P2(5′-CTC CCG TGA AGC CGT AAA A-3′) 和TaqMan 探針(FAM-5′- CAG CTT GCC CTC AAG GTG ACG TG -3′-TAMRA)。引物和探針由大連(寶)生物工程有限公司合成。

1.4引物和探針濃度的篩選 用矩陣法對(duì)FQ-PCR的循環(huán)參數(shù)、引物和探針濃度以及所選引物與探針的組合等進(jìn)行篩選優(yōu)化，以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

1.5敏感性試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 用含pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒的溶液作標(biāo)準(zhǔn)品，10倍系列稀釋成1.0×1010～1.0×100拷貝/μL，共11個(gè)稀釋度，以不同濃度的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行FQ-PCR敏感性試驗(yàn)。以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，以FQ-PCR循環(huán)次數(shù)Ct值為Y軸作回歸曲線(xiàn)，建立PCMV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.6特異性試驗(yàn) 采用pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒作模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量特異性實(shí)驗(yàn)，按照文獻(xiàn)報(bào)道[8]的方法利用Kinfisher全自動(dòng)核酸儀、采用磁珠法進(jìn)行PCV2、PPV 、PRV、PRRSV、SS、CSFV的總DNA和RNA提取，并采用河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心已建立成功的RT-PCR方法對(duì)RNA病毒進(jìn)行全長(zhǎng)反轉(zhuǎn)錄，然后對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA和提取的總DNA進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)，并設(shè)空白對(duì)照以檢驗(yàn)本方法的特異性。

1.7穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn) 用FQ-PCR法對(duì)模板質(zhì)粒DNA 含量分別為1.0×108，1.0×106和1.0×104拷貝/μL的3個(gè)濃度樣品分別進(jìn)行6次重復(fù)檢測(cè)，以檢驗(yàn)該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.8與常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度的比較 以pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍系列稀釋成1.0×1010～1.0×100拷貝/μL，以其為模板進(jìn)行FQ-PCR，同時(shí)利用河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心已建立成功的PCMV常規(guī)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)，以比較2種方法檢測(cè)靈敏度。

1.9臨床應(yīng)用性試驗(yàn) 提取臨床表現(xiàn)為食欲下降、精神沉郁，皮膚發(fā)紅、眼瞼水腫或嚴(yán)重的結(jié)膜炎，噴嚏、咳嗽、流淚、鼻腔分泌物增多，下頜水腫等疑似PCMV感染的病死仔豬的15份扁桃體樣品總DNA，以pGEM-T/PCMV為陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)菌雙蒸水為陰性對(duì)照進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增；同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證二者的符合率。

1.10病毒在不同內(nèi)臟器管分布檢測(cè) 選取6頭PCMV FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的豬，采用建立的FQ-PCR方法對(duì)來(lái)自同一頭豬的血清和扁桃體、肺臟、氣管、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、肝臟、膀胱、胃、心臟、小腸等內(nèi)臟器管進(jìn)行PCMV病毒含量檢測(cè)，以比較PCMV在豬體不同器官的含量分布。

2 結(jié) 果

2.1pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒DNA濃度的測(cè)定 提取的pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒DNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，其100倍稀釋的OD260平均值為0.046，OD280平均值為0.024 6，OD260/ OD280平均值為1.870。參照文獻(xiàn)的方法[8]，計(jì)算所提質(zhì)粒DNA溶液的濃度為6.18×1010拷貝/μL。由于所克隆基因在PCMV中為單一拷貝，故用此質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.2FQ-PCR反應(yīng)條件的確定 采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，結(jié)果表明，采用終濃度為5 μmol/L的引物濃度和2.5 μmol/L的探針濃度對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，可獲得較小的反應(yīng)循環(huán)數(shù)(Ct值)和較大的熒光信號(hào)(△Rn)。FQ-PCR循環(huán)條件優(yōu)化結(jié)果表明，雙溫循環(huán)及60 ℃的退火溫度為最佳的循環(huán)條件。確定的FQ-PCR反應(yīng)總體積為25 μL，其中10×ExTaqBuffer 2.5 μL(Mg2+濃度為2.0 mmol/L)，dNTPs 2 μL，ExTaq酶 0.25 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，探針0.25 μL(10 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 18.00 μL，混合均勻，置ABI 7 000熒光定量PCR儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；然后94 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，熒光模式設(shè)為FAM/TAMRA雙標(biāo)記模式。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及FQ-PCR的靈敏度 以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒 (1.0×1010～1.0×100拷貝/μL)為模板進(jìn)行FQ-PCR，當(dāng)重組質(zhì)粒濃度稀釋為1.0×100拷貝/μL時(shí)，熒光曲線(xiàn)的最高△Rn值在2 000左右，Ct值為29.87，表明該方法檢測(cè)時(shí)的靈敏度為1.0×100拷貝/μL(圖1)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果所計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.998，斜率為-2.54，截距為38.39，從而可以得出拷貝數(shù)(X)與Ct值之間的線(xiàn)性關(guān)系表達(dá)式為：Ct=-2.54×logX+38.39。將由儀器讀取的Ct值代入上述表達(dá)式即可算出初始拷貝數(shù)。

圖110倍梯度稀釋的PCMV重組質(zhì)粒的FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果

1～11:對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒模板濃度依次分別為1.0×1010，1.0×109，1.0×108，1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×102，1.0×101和1.0×100拷貝/μL；N. 陰性對(duì)照

Fig.1DetectionresultsoftherecombinantpGEM-T/PCMVwith10foldserialdilutionsbytheFQ-PCRassay

Curves from No.1 to No.11 indicate FQ-PCR results of the recombinant pGEM-T/PCMVplasmid concentrations of 1.0×1010, 1.0×109, 1.0×108, 1.0×107, 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104, 1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, and 1.0×100copies/μL, respectively. Carve N is the negative control.

2.4FQ-PCR的特異性 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照有熒光響應(yīng)，而6個(gè)對(duì)照病原體、陰性對(duì)照無(wú)熒光響應(yīng)(圖3)，說(shuō)明所建立的PCMV FQ-PCR檢測(cè)方法具有好的特異性。

2.5FQ-PCR的穩(wěn)定性和重復(fù)性 以3個(gè)濃度的pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定，其結(jié)果如圖4所示。通過(guò)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析得知，起始濃度為1.0×108，1.0×106，1.0×104拷貝/μL的pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)際測(cè)得值分別為1.001×108，1.002×106，0.999×104拷貝/μL，表明此方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖2 根據(jù)圖1的結(jié)果建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖3FQ-PCR方法的特異性

1: 陽(yáng)性對(duì)照； 2～6: PCV2、PPV 、PRV、PRRSV、SS、CSFV；N: 陰性對(duì)照

Fig.3SpecificitytestresultsoftheFQ-PCRmethod

Curves of No.1 indicate the FQ-PCR results of recombinant pGEM-T/PCMV plasmid with concentrations of 1.0×107copies/μL, respectively.

Curves from No.2 to No.6 indicate the FQ-PCR results of the controls including the PCV2, PPV, PRV, PRRSV, SS, and CSFV, respectively.

Carve N indicates the FQ-PCR results of the negative control.

圖4FQ-PCR的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

1～3: 自左向右分別以濃度為1.0×108，

1.0×106，1.0×104拷貝/μL的pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒為模板FQ-PCR方法重復(fù)擴(kuò)增6次的結(jié)果

Fig.4AccuracyandrepetitionassayresultsoftheFQ-PCRmethod

Curve from No.1 to No.4 indicated the repetition 6 times results of the recombinant pGEM-T/PCMV plasmid with the concentrations of 1.0×108, 1.0×106and 1.0×104copies/μL, respectively.

2.6FQ-PCR與常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度的比較 采用常規(guī)PCR方法檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)的極限靈敏度為1.0×102個(gè)拷貝/μL；FQ-PCR的檢測(cè)靈敏度為1個(gè)拷貝/μL(圖1)；表明 FQ-PCR方法的檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的100倍。

2.7FQ-PCR與常規(guī)PCR對(duì)臨床樣品檢測(cè)結(jié)果的比較 將疑似PCMV感染扁桃體組織樣品和pGEM-T/PCMV陽(yáng)性重組質(zhì)粒，分別采用所建立的FQ-PCR和常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果二種檢測(cè)方法均檢出9份陽(yáng)性樣品，對(duì)pGEM-T/PCMV陽(yáng)性重組質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，二種方法檢測(cè)結(jié)果完全相符(圖5，圖6)。

圖5疑似PCMV感染扁桃體組織樣品常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖

M:100 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照；P: 陽(yáng)性對(duì)照(pGEM-T/PCMV)；N:陰性對(duì)照；1～15:臨床疑似PCMV感染豬扁桃體病料

Fig.5RoutinePCRamplificationofthe15clinicsuspiciousPCMVinfectedtonsiltissues

M: 100 bp DNA marker;P and N: PCR results of the positive and negative control, respectively;

Lane 1-15: 15 clinic suspicious PCMV infected tonsil tissue samples, respectively.

圖6FQ-PCR檢測(cè)臨床疑似樣品部分應(yīng)用試驗(yàn)

1：pGEM-T/PCMV；2～10：PCMV陽(yáng)性樣品的FQ-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)；11～16：PCMV陰性樣品的FQ-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)；N：空白對(duì)照樣品

Fig.6ApplicationofFQ-PCRassaybydetectionoftheclinicsuspiciousPCMVinfectedtonsiltissue

1: Curves of the recombinant pGEM-T/PCMV plasmid;

2-10: Curves of the 9 positive samples of the 15 clinic suspicious PCMV infected samples;

11-16: Curves of the 6 negative samples of the 15 clinic suspicious PCMV infected samples;

N: Blank negative sample control

2.8病毒在不同內(nèi)臟器管分布 對(duì)6頭PCMV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性豬的血清和不同內(nèi)臟器官中PCMV病毒含量的定量檢測(cè)排序結(jié)果完全一致，其中PCMV含量最高的器官為豬扁桃體，最低的為小腸；按照病毒含量從高到低的順序依次為：扁桃體、肺臟、腎臟、胃、心臟、腹股溝淋巴結(jié)、肝臟、膀胱、腸系膜淋巴結(jié)、氣管、血清、脾臟、小腸。

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)PCMV感染狀況的研究較少，開(kāi)展PCMV病原學(xué)快速診斷方法研究，可掌握PCMV在我國(guó)豬群中的感染狀況，了解PCMV近年來(lái)對(duì)豬群健康的危害，從而及早采取有效防控措施防控該病的流行和發(fā)生。另外，在異種器官移植方面，豬是異種移植器官供體的最佳候選者[9]，近年來(lái), 國(guó)外關(guān)于PCMV的報(bào)道主要集中在其對(duì)異種移植的影響方面, 研究發(fā)現(xiàn)β皰疹病毒包括人皰疹病毒6型、7型(HHV-6、HHV-7)及CMV能夠在器官移植后引起器官移植受者產(chǎn)生機(jī)會(huì)感染, 由此產(chǎn)生一系列癥狀和疾病, 統(tǒng)稱(chēng)為人巨細(xì)胞病毒疾病。目前雖然沒(méi)有PCMV在體內(nèi)傳染給人類(lèi)的直接證明, 但已有研究表明PCMV在體外能在人成纖維細(xì)胞中增殖[10]，因此PCMV可能由帶毒豬器官隨器官移植傳染給人，成為人體器官移植的重要傳染病[11-13]。本研究進(jìn)一步證明同為皰疹病毒科的PCMV可能是異種移植中潛在的動(dòng)物傳染源。鑒于PCMV在豬體內(nèi)的高陽(yáng)性率, 對(duì)于人類(lèi), PCMV也可能成為一種潛在的風(fēng)險(xiǎn)源。

PCMV的詳細(xì)基因組結(jié)構(gòu)尚不清楚，僅見(jiàn)有DNA聚合酶(DPOL)、gB、MCP等幾個(gè)基因的研究。DPOL是PCMV能正確和高效復(fù)制所需的基本因子之一，是PCMV血清型特異性的單拷貝基因，選取DPOL基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)PCR引物，可確保PCMV PCR檢測(cè)的特異性。本研究所建立的FQ-PCR方法以PCMV的DPOL基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)探針和引物，在特異性方面具有雙重保證，因此具有較常規(guī)PCR更高的特異性。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，F(xiàn)Q-PCR對(duì)不同濃度的pGEM-T/PCMV重組質(zhì)粒呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，可檢測(cè)到1拷貝/μL的病毒，而對(duì)6個(gè)對(duì)照病原菌均呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，說(shuō)明本研究所建立的FQ-PCR方法具有很高的特異性和靈敏度。另外，對(duì)同一樣品重復(fù)多次檢測(cè)均可得到一致的Ct值和熒光強(qiáng)度，表明所建立的FQ-PCR方法具有很高的穩(wěn)定性和重復(fù)性。利用FQ-PCR方法進(jìn)一步對(duì)15份臨床疑似PCMV感染病死仔豬扁桃體組織樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR方法的檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明該方法可成功用于PCMV快速診斷和臨床應(yīng)用檢測(cè)。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外已有多名學(xué)者報(bào)道建立了針對(duì)PCMV的常規(guī)PCR檢測(cè)方法[14-17]，但尚未有PCMV熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。本研究首次建立了PCMV熒光定量PCR診斷方法，與常規(guī)PCR方法相比，該方法診斷更加迅速，整個(gè)反應(yīng)可在1～2 h內(nèi)完成，而且不需要電泳，從而大大降低了對(duì)環(huán)境的污染，且其檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR方法的100倍，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。因此， FQ-PCR方法對(duì)于PCMV的早期快速檢測(cè)診斷、防控、凈化及研究PCMV與其它病原體的混合感染及相互作用等方面具有意義。

本研究對(duì)來(lái)自6頭PCMV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性豬的血清和不同內(nèi)臟器官中的PCMV含量進(jìn)行了定量研究，盡管6頭豬的同一器官中PCMV病毒含量不盡相同，但不同內(nèi)臟器官中PCMV病毒含量排序結(jié)果完全一致，即扁桃體、肺臟、腎臟較高，腸系膜淋巴結(jié)、氣管、血清、脾臟、小腸較低。這為PCMV的檢測(cè)、診斷、分離等研究提供了依據(jù)。

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