王嘉正，梁俊容，邱海燕，段 然，肖玉春，王 鑫，景懷琦

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種革蘭陰性的腸道病原菌，它通過糞口傳播途徑感染人體，除了能引起多種胃腸道疾病外，由其引發(fā)的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、耶爾森菌肝炎等更是引起人們的廣泛關(guān)注。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌有六種生物型。其中，生物1A型為非致病性菌，2-5型為低致病菌，1B為高致病菌。在成為腸道病原菌之前，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌需要先穿過胃部，定植并在腸粘膜內(nèi)擴(kuò)散，這就要求其具有一定的抗酸能力[1-2]。有數(shù)據(jù)表明盡管小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的最適pH生長范圍是7.0至8.0，但它在pH值5.0至9.0的范圍內(nèi)都能生存[3-4]甚至在pH4.4的情況下仍然能夠存活48 h[5]。盡管現(xiàn)在還無法確切的知道小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的耐酸機(jī)制，但我們猜想尿素酶在這其中可能發(fā)揮著重要作用[3]。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的尿素酶基因是由7個開放讀碼框(ureA, B, C, E, F, G and D)構(gòu)成[6]。其中ureA、ureB、ureC是結(jié)構(gòu)基因，ureE、ureF、ureG、ureD是附加基因，它們編碼的蛋白共同組成一個完整的尿素酶分子。尿素酶可以水解尿素產(chǎn)生氨氣和碳酸，氨氣中和了H+，溶液的pH值隨之提高，從而使細(xì)菌獲得耐酸能力。既然尿素酶能夠增加小腸結(jié)腸炎耶爾森菌抵御胃酸的能力而使其成為腸道病原菌，那么小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病力的強(qiáng)弱與尿素酶的活性之間是否具有一定關(guān)聯(lián)？為了弄清這個問題，本研究選取不同致病力的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，通過PCR擴(kuò)增和測序進(jìn)行尿素酶基因的多態(tài)性分析，同時測定尿素酶活力以了解不同致病力菌株尿素酶活性之間的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株 選取跨越25年，分離自福建、吉林、浙江等9個省的43株不同致病力的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及4株NCBI上尿素酶基因參考序列，見表1。

表1 43株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的生物血清型及4株尿素酶基因測序株的NCBI Reference Sequence或GenBank號

1.2方法

1.2.1核酸提取及PCR DNA提取和PCR擴(kuò)增體系參照[7]。引物序列見表2、表3。

擴(kuò)增條件(ureABCEFGD條件一樣)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，53.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.2DNA測序及結(jié)果分析 將PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的引物，送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

測序結(jié)果用DNAStar軟件的SeqMan模塊進(jìn)行序列拼接和ORF的截取，并將每株菌尿素酶基因(ureABCEFGD)的7個ORF按順序拼接在一起，再連同4株NCBI上尿素酶基因參考序列一起用MEGA軟件進(jìn)行比對和構(gòu)建序列的聚類樹。

表2 非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶引物

表3 致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶引物

1.2.3尿素酶活性測試 選取8株不同致病力的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(生物血清型及致病力強(qiáng)弱見表4)。傳菌并分別刮取適量菌苔制成菌懸液，麥?zhǔn)媳葷嶂翝岫葹?.2麥?zhǔn)蠁挝?當(dāng)麥?zhǔn)蠞岫葹?.2時小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌量約為108個/mL)，倍比稀釋將菌的濃度依次調(diào)整為108、107、106個/mL。取200 μL 102個/mL濃度的菌液涂平板(每個濃度涂3塊平板)并進(jìn)行菌落計數(shù)取平均值，以確定實(shí)際菌量。每株菌的三個濃度梯度分別取0.5 μL 菌液離心，棄上清，用0.5 μL 的尿素培養(yǎng)液重懸菌體后加入到4.5 μL 的尿素培養(yǎng)液中混勻，同時設(shè)置一個陰性對照(陰性對照加入5 μL 的尿素培養(yǎng)液，不加菌液)。放入25 ℃敷箱中培養(yǎng)，每隔一小時拍照并記錄顏色變化，連續(xù)觀察66 h。

2 結(jié) 果

2.1測序結(jié)果 在不同致病力小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的比對和聚類分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：

41株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶基因的ORF序列可聚為3組，低致病性O(shè)∶3、O∶9血清型菌株、高致病性 O∶8血清型菌株各自聚為一組，而6株非致病性菌株的尿素酶ORF可聚為3組(聚類結(jié)果見圖1)。

在低致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中，所有18株O∶3血清型菌株的尿素酶基因7個開放讀碼框(ureABCEFGD)的序列完全一致；17株O∶9血清型菌株中有16株尿素酶基因的七個開放讀碼框(ureABCEFGD)的序列完全一致，只有NX1997-IE419與其他O∶9血清型菌株的尿素酶基因序列不同，而NX1997-IE419與O∶3血清型菌株的序列非常接近。高致病菌與非致病菌的尿素酶基因序列相對不保守，除與低致病性菌株的尿素酶基因序列存在差異外，各菌株之間尿素酶基因也存在較大的多態(tài)性。

圖147株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶基因的聚類分析

(紅色為非致病菌，黃色為高致病菌，藍(lán)色和綠色分別為O∶9血清型和O∶3血清型低致病菌)

Fig.1Cladogrambasedon43Yersiniaenterocoliticaureasegene

Red shadow represented non-pathogenic strain. Yellow shadow represented high pathogenic strain. Blue shadow represented O∶9 low pathogenic strain and green shadow represented O∶3 low pathogenic strain.

2.2菌落計數(shù)結(jié)果及菌的濃度 25 ℃隔夜培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落計數(shù)，并利用公式：濃度=(N1+N2+N3)/3×5×106推算出每株菌相應(yīng)的濃度(見表4)。

2.3尿素酶活性測試結(jié)果 在尿素酶活性實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)：非致病株HA2006-HN-Ye-053的3個濃度梯度的反應(yīng)，無論在變色的起始時間還是變色的終止時間上均早于其他的7株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(具體反應(yīng)的變色起始時間和變色終止時間見表5)。高致病菌YE92010 108濃度梯度的反應(yīng)于20 h開始變色，而此時非致病株HA2006-HN-Ye-053以及低致病株NX1998-SA98-837已發(fā)生了明顯的顏色變化。在第27h，非致病株HA2006-HN-Ye-053 108濃度梯度的反應(yīng)結(jié)束，早于其他致病菌。45h時，低致病株NX1998-SA98-837 108濃度梯度的反應(yīng)也到達(dá)終點(diǎn)，早于高致病株52211和YE92010。66h時，高致病株52211 107和106濃度梯度的反應(yīng)尚在進(jìn)行中，但非致病株HA2006-HN-Ye-053以及低致病株NX1998-SA98-837、LN1996-YE105.5R三個濃度梯度的反應(yīng)都已達(dá)到終點(diǎn)，見圖2。

表4 尿素酶活力試驗(yàn)所選菌株及菌落計數(shù)結(jié)果和相應(yīng)的濃度

注：由于生物1A型非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清型別眾多，分型血清種類有限，且其與現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室分型血清均不凝集，無法確定其血清型，故為UN。

Note: Non-pathogenicYersiniaenterocolitica(biotype 1A) had many serotypes. However, serotyping kind was limited and some strain cannot agglutinate with serum in our laboratory. Because serotype can’t be determined, we defined them as UN.

3 討 論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種腸道病原菌，能引起包括：胃腸炎、腸系膜淋巴結(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和敗血癥在內(nèi)的多種疾病[8-9]。尿素酶是一種含鎳的蛋白酶，在諸如幽門螺桿菌、產(chǎn)氣克雷伯菌、奇異變形桿菌以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等細(xì)菌中都有尿素酶的存在[10]。它通過水解尿素產(chǎn)生氨氣和碳酸，而氨氣能夠中和溶液中的H+，從而增強(qiáng)病原菌的耐酸能力，使病原菌在胃酸中有更強(qiáng)的生存能力[3]。尿素酶基因由多個ORF構(gòu)成，它們功能相關(guān)前后連接成串形成一個尿素酶操縱子。尿素酶基因在細(xì)菌種內(nèi)相對保守，而在不同的屬間則可能存在一定的差異[11]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的尿素酶基因是由7個開放讀碼框(ureA, B, C, E, F, G and D)構(gòu)成[6]，其中ureA、ureB、ureC是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶基因的結(jié)構(gòu)基因，分別編碼γ、β、α蛋白亞單位，γ、β、α蛋白亞單位共同構(gòu)成尿素酶的核心部分，單獨(dú)的核心部分是沒有活性的。ureE、ureF、ureG、ureD是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶基因的附加基因，附加基因編碼的蛋白能夠使Ni離子與尿素酶核心部分結(jié)合，從而形成一個完整的有活性的尿素酶分子。

本實(shí)驗(yàn)中我們選取43株不同致病力的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行尿素酶基因的測序和多態(tài)性分析。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)18株低致病性O(shè)∶3血清型菌株的尿素酶基因7個開放讀碼框(ureABCEFGD)的序列完全一致；17株低致病性O(shè)∶9血清型菌株中有16株的尿素酶基因7個開放讀碼框(ureABCEFGD)的序列完全一致，只有NX1997-IE419與其他O∶9血清型菌株的尿素酶基因序列不同。由此我們發(fā)現(xiàn)低致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的尿素酶基因序列比較保守并且與血清型密切相關(guān)，O∶9血清型(NX1997-IE419)菌株的尿素酶基因可能是起源于O∶3血清型的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。高致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和非致病性小腸結(jié)腸炎的尿素酶基因均呈現(xiàn)出不保守性，不僅與低致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌存在很多個位點(diǎn)的突變，而且在所有高致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的開放讀碼框ureE中都會出現(xiàn)不同程度的堿基插入現(xiàn)象。在高致病株的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌各菌株之間也存在很多個位點(diǎn)的不同。

在尿素酶的活性測定實(shí)驗(yàn)中，我們可以看出在一定范圍內(nèi)，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌量越多，尿素酶反應(yīng)發(fā)生的時間越早，即尿素酶活性越大。非致病菌HA2006-HN-Ye-053的變色起始時間早于其他的7株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，且其到達(dá)尿素酶終止反應(yīng)的時間也最早，顯示其尿素酶活性很強(qiáng)。而高致病株YE92010的反應(yīng)時間長于非致病株HA2006-HN-Ye-053以及低致病株NX1998-SA98-837。尿素酶是尿素分解的必要條件，雖然它在細(xì)菌體內(nèi)合成，但它的活性表達(dá)除了與本身不同尿素酶基因編碼的多亞基聚合體有關(guān)，還受到外界環(huán)境因素的影響。本研究中可以看出：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶的活性與其致病性之間并未呈現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)。這表明尿素酶雖然能夠賦予小腸結(jié)腸炎耶爾森菌一定的耐酸能力并在一定程度上增加了腸道中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的數(shù)量，但是致病性強(qiáng)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌其尿素酶活性不一定強(qiáng)。這提示我們小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病力的強(qiáng)弱并不是由尿素酶直接決定的，決定致病力強(qiáng)弱的主要因素可能還是毒力質(zhì)粒及侵襲素毒力基因等的有無和種類，尿素酶對于毒力強(qiáng)弱的貢獻(xiàn)可能只是輔助性的。此外，相同基因型的Pa134和NX1998-SA98-837菌株之間的反應(yīng)時間差距也很大。這提示我們一級結(jié)構(gòu)雖然是尿素酶蛋白的功能的基礎(chǔ)，但并不能直接決定尿素酶總活性的大小，尿素酶的總活性的大小可能還受其表達(dá)量、外界環(huán)境等諸多因素的影響，這些因素還需我們進(jìn)一步探索。

表5 8株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的變色起始時間和終止時間(觀察到66h)

圖28株不同致病力小腸結(jié)腸炎耶爾森菌尿素酶反應(yīng)的顏色變化

4張圖片分別是20 h、27 h、45 h、66 h的顏色變化。每張圖片A排1、2、3號和4、5、6號分別是52211 和JP0000-YE92010 108、107、106三個濃度梯度的反應(yīng)情況。B排1、2、3和4、5、6號分別是NX1998-SA98-837和 JP0000-Pa134菌株3個濃度梯度的反應(yīng)。C排1、2、3號和4、5、6號分別是NX1997-IE419和LN1996-YE105.5R菌株3個濃度梯度的反應(yīng)。D排1、2、3號和4、5、6號分別是非致病菌HA2006-HN-Ye-053和JS1986-Y40 菌株3個濃度梯度的反應(yīng)。每張圖的7號一豎排是陰性對照。

Fig.2UreasereactioncolorchangeofeightdifferentpathogenicYersiniaenterocolitica

These 4 pictures represented color change of 20 h, 27 h, 45 h, and 66 h respectively;In each picture, number 1, 2, 3 and number 4, 5, 6 of rowA represented three concentration gradients (108,107,106) of 52 211 and JP0000-YE92010 respectively;

Number 1, 2, 3 and number 4, 5, 6 of rowB represented three concentration gradients of NX1998-SA98-837 and JP0000-Pa134 respectively;

Number 1, 2, 3 and number 4, 5, 6 of rowC represented three concentration gradients of NX1997-IE419 and LN1996-YE105.5R respectively;

Number 1, 2, 3 and number 4, 5, 6 of rowD represented three concentration gradients of HA2006-HN-Ye-053 and JS1986-Y40 respectively;

Number 7 of each picture is negative control.

參考文獻(xiàn)：

[1]Giannella RA, Broitman SA, Zamcheck N, et al. Influence of gastric acidity on bacterial and parasitic enteric infections: a perspective[J]. Ann Intern Med, 1973, 78(2): 271-276. DOI: 10.7326/0003-4819-78-2-271

[2]De Koning-Ward TF, Robins-Browne RM. A novel mechanism of urease regulation inYersiniaenterocolitica[J]. FEMS Microbiol Lett, 1997, 147(2): 221-226. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1997.tb10245.x

[3]De Koning-Ward TF, Robins-Browne RM. Contribution of urease to acid tolerance inYersiniaenterocolitica[J]. Infect Immun, 1995, 63(10): 3790-3795. DOI: 10.1111/j.1745-4565.2011.00325.x

[4]Hanna M, Stewart J, Carpenter Z, et al. Effect of heating, freezing, and pH [hydrogen-ion concentration]onYersiniaenterocolitica-like organisms from meat[J]. J Food Protect, 1977, 40(10): 689-692.

[5]Stern NJ, Pierson M, Kotula A. Effects of pH and sodium chloride onYersiniaenterocoliticagrowth at room and refrigeration temperatures[J]. J Food Sci, 1980, 45(1): 64-67. DOI: 10.1111/j.1365-2621.1980.tb03871.x

[6]De Koning-Ward TF, Ward AC, Robins-Browne RM. Characterisation of the urease-encoding gene complex ofYersiniaenterocolitica[J]. Gene, 1994, 145(1): 25-32. DOI: 10.1016/0378-1119(94)90318-2

[7]Gu WP. Comparative related-antigens and proteomic analysis of the pathogenicYersiniaenterocoliticabio-serotype 1B/O∶8 and 2/O∶9 cultured at different temperatures[D]. Beijing:Chinese Center for Infectious Disease Prevention and Control, 2011.(in Chinese)

古文鵬.致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物血清型1B/O∶8和2/O∶9不同溫度培養(yǎng)條件下相關(guān)抗原和蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究[D].中國疾病預(yù)防控制中心，2011.

[8]Cornelis G, Laroche Y, Balligand G, et al.Yersiniaenterocolitica, a primary model for bacterial invasiveness[J]. Rev Infect Dis, 1987, 9(1): 64-87. DOI: 10.1093/clinids/9.1.64

[9]Cover TL, Aber RC.Yersiniaenterocolitica[J]. N Engl J Med, 1989, 321(1): 16-24.

[10]Mobley H, Island MD, Hausinger RP. Molecular biology of microbial ureases[J]. Microbiol Revm, 1995, 59(3): 451-480.

[11]De Koning-Ward TF, Robins-Browne RM. Analysis of the urease gene complex of members of the genusYersinia[J]. Gene, 1996, 182(1): 225-228. DOI: 10.1016/S0378-1119(96)00556-2