吳巨龍，王 絢，呂 剛，蘇 娟，逯召蓮，孫萃萍，景 濤,2

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，Eg，又名單房包蟲)病是流行于我國(特別是西北地區(qū))常見的人獸共患寄生蟲病，是我國規(guī)劃防治的五大寄生蟲病之一[1]。

目前研究中，人們多采用多價復(fù)合疫苗即“雞尾酒”式疫苗對其進(jìn)行預(yù)防[2]。

甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶。在糖酵解過程中，GAPDH催化3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變成1, 3-二磷酸甘油酸, 后者作為底物在3-磷酸甘油酸激酶催化下生成3-磷酸甘油酸，同時生成一個ATP[3]。在寄生蟲, GAPDH的含量非常豐富[4]。

本研究通過篩選細(xì)粒棘球絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫, 尋找、識別出細(xì)粒棘球絳蟲GAPDH(EgGAPDH)基因,將其編碼區(qū)克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)中, 表達(dá)出融合蛋白, 并檢測其生活學(xué)活性，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)粒棘球絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫、載體和菌株 細(xì)粒棘球絳蟲成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫以及EST序列測序結(jié)果，原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)和大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ，dNTP，蛋白質(zhì)Marker，T4 DNA連接酶，Tag酶，質(zhì)粒抽提試劑盒，DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；Ni-NTA層析柱、4 500 bp DNA Marker購自Qiagen公司；IPTG，一磷酸腺苷(AMP)購自北京索萊寶公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、3-磷酸甘油醛、二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1EgGAPDH 生物信息學(xué)分析 開放閱讀框識別采用ORF Finder軟件；理化性質(zhì)分析采用ProtParam網(wǎng)站；保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測采用NCBI的CD-Search工具；用MEGA5.1工具構(gòu)建進(jìn)化樹；蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分別采用predictprotein和SWISS-MODEL網(wǎng)站預(yù)測。

1.2.2cDNA文庫的篩選及目的基因的擴(kuò)增 細(xì)粒棘球絳蟲成蟲cDNA文庫經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選白色菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pBlue-EgGAPDH。根據(jù)EgGAPDH基因序列，設(shè)計(jì)1對引物，在每條引物的5′端分別引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。引物的序列為：

上游：5′-CAGAATTCATGAAGCCCCAGGTC-3′，

下游：5′-CGGAAGCTTTTAATGATCCCTCT-3′，

下劃線序列為酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增目的基因序列，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物后切膠回收并純化目的片段。

1.2.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 取純化好的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET30a(+)，分別用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切后，在T4連接酶的作用下16 ℃過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到已制備好的感受態(tài)菌BL21(DE3)中。用含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌株后，提取重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定，送上海生工有限公司測序。

1.2.4重組EgGAPDH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化鑒定和蛋白濃度的測定 將重組菌接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖菌，培養(yǎng)6 h，收集菌液，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，20 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后，12 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀后用15 mL純水重懸，超聲8 min，用Ni-NTA層析柱純化。通過12%SDS-PAGE檢測純化的蛋白。用Bradford法測定重組蛋白的濃度。

1.2.5EgGAPDH 重組蛋白體外酶活力分析 酶活性測定參照文獻(xiàn)[5]所述方法進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1理化性質(zhì)的預(yù)測 對由cDNA序列推測得到的GAPDH蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)，其理論相對分子質(zhì)量為36 128.3 Da，等電點(diǎn)為8.44。

2.1.2保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測 該蛋白具有2個保守功能結(jié)構(gòu)域，分別是位于N端(第4-159位)的Rossmann NAD(P)結(jié)合功能域和位于C端(第156-314位)行使糖運(yùn)輸和代謝的催化功能域。

2.1.3分子進(jìn)化樹的構(gòu)建 應(yīng)用MEGA5.1工具，將細(xì)粒棘球絳蟲與GenBank上已登錄的多房細(xì)粒棘球絳蟲EmGAPDH(登錄號：U19101.1)，豬肉絳蟲TsGAPDH(登錄號：EF468494.1)，人HsGAPDH (登錄號：BC029618.1)，日本血吸蟲SjGAPDH(登錄號：FN316854.1)，華支睪吸蟲CsGAPDH(登錄號：DF127286.1)，惡性瘧原蟲PfGAPDH(登錄號：AF030440.1)，剛地弓形蟲TgGAPDH(登錄號: AF265361.1)，秀麗隱桿線蟲CeGAPDH(登錄號：X04818.1)，馬來絲蟲BmGAPDH(登錄號：U18137.1)，克氏錐蟲TcGAPDH(登錄號：X52898.1)，嬰兒利什曼原蟲LiGAPDH(登錄號：XM_001467109.1)等11種動物的GAPDH氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析后，運(yùn)用MEGA5.1軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)。從圖中可以看出，細(xì)粒棘球絳蟲GAPDH與多房棘球絳蟲的GAPDH親緣關(guān)系最近，與豬肉絳蟲次之，與惡性瘧原蟲、嬰兒利什曼原蟲等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1EgGAPDH系統(tǒng)發(fā)生樹(數(shù)字代表進(jìn)化距離)

Fig.1Analysisofphylogeny(thenumberindicateevolutiondistance)

2.1.4二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 該蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占26.79%，β-折疊占30.36%，環(huán)狀結(jié)構(gòu)占42.86%。預(yù)測該蛋白有4個N-糖基化位點(diǎn)，6個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，1個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，4個N-豆蔻?；稽c(diǎn)，1個甘油醛3-磷酸脫氫酶活性位點(diǎn)。分析蛋白跨膜區(qū)，結(jié)果表明該蛋白為一個胞質(zhì)內(nèi)蛋白。

2.1.5三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測EgGAPDH的三維結(jié)果如圖2所示，紅色部分為酶的活性位點(diǎn)(aa149-156，序列為ASCTTNCL)，從圖2可以看出，EgGAPDH的活性位點(diǎn)是位于蛋白三維結(jié)構(gòu)的表面部分。

圖2 EgGAPDH的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2EgGAPDH 基因PCR擴(kuò)增EgGAPDH 基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 在約1 011 bp處顯示1條清晰的條帶，見圖3。

2.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定 將重組表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,檢測到插入片斷大小約1 011 bp, 與目的基因片段相符，見圖4。

2.4重組pET30a(+)-EgGAPDH 蛋白表達(dá)、分離純化及濃度測定 收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)過夜的重組菌，超聲裂解后進(jìn)行12%SDS-PAGE分離，上清和沉淀中均有明顯的目的蛋白，對上清蛋白采用Ni-NTA柱進(jìn)行分離純化。結(jié)果如圖5所示。重組蛋白的濃度為0.42±0.03 mg/mL。

圖3EgGAPDH基因PCR鑒定(1%瓊脂糖凝膠電泳)

Fig.3IdentificationoftheamplifiedproductofGAPDHgene(1.0%agrosegelelectrophoresis)

1: Amplified product of GAPDH gene; M: DNA standard marker.

圖4pET30a(+)-GAPDH重組體雙酶切鑒定(1.0%瓊脂糖凝膠電泳)

Fig.4IdentificationoftherecombinantpET30a(+)-GAPDHdigestedwithEcoRⅠandHindⅢ (1.0%agarosegelelectrophoresis)

M: DNA standard marker; 1: Recombinant pET30a(+)-GAPDH digested withEcoRⅠ andHind Ⅲ.

2.5EgGAPDH重組蛋白體外酶活力分析 表1顯示, 在重組蛋白EgGAPDH的酶反應(yīng)體系中, BSA加底物對照組和EgGAPDH未添加底物組均未見酶活,而EgGAPDH加底物組的A340值反應(yīng)前后明顯不同，A340值隨重組蛋白EgGAPDH加入量的增多而增高。表明所獲重組蛋白EgGAPDH具有酶催化活性。

在低酶量組反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，加入0.5 mL不同濃度的一磷酸腺苷(AMP)，測定其對催化底物轉(zhuǎn)化量NADH的影響。其結(jié)果見表2。

如表2結(jié)果所示，在所建立的GAPDH反應(yīng)體系中，未加入一磷酸腺苷(AMP)時體系所測得的吸光度值隨反應(yīng)時間呈持續(xù)上升趨勢，表明此體系中有反應(yīng)發(fā)生。當(dāng)加入0.5 mL 0.5 mmol/L的AMP時，體系所測得的吸光度值總體趨勢仍上升，但相比第一組明顯下降，表明AMP對體系中的反應(yīng)產(chǎn)生抑制。當(dāng)加大AMP量至0.5 mL 2 mmol/L時，體系所測定的吸光度值繼續(xù)下降，表明對反應(yīng)的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

表1 重組蛋白EgGAPDH 的酶反應(yīng)體系吸光度( A340值,

表2 一磷酸腺苷(AMP)對GAPDH酶反應(yīng)體系光密度值的影響

圖5重組pET30a(+)-GAPDH蛋白SDS-PAGE分析

Fig.5SDS-PAGEanalysisofthepET30a(+)-GAPDHprotein

M: Standard molecular weight protein marker;

1: pET30a(+)-EgGAPDH total of sonificated bacterial lysates;

2: pET30a(+)-EgGAPDH supernatant of sonificated bacterial lysates;

3: pET30a(+)-EgGAPDH deposition of sonificated bacterial lysates;

4: The purifiedEgGAPDH.

3 討 論

GAPDH廣泛存在于原核生物和真核生物中，在生物體的糖代謝中有著重要的作用。GAPDH由單一基因編碼, 是一個高度保守的基因。GAPDH基因在所有的組織中的表達(dá)相對衡量、持續(xù)，在分子生物學(xué)的研究中，常被用作內(nèi)參基因[6]。該基因除了在細(xì)胞糖酵解過程中產(chǎn)生重要作用外, 還執(zhí)行不同的生物學(xué)功能, 這與GAPDH在亞細(xì)胞中的定位有關(guān)[7]。分布在細(xì)胞膜的GAPDH主要執(zhí)行內(nèi)吞功能, 參與大分子的運(yùn)輸。細(xì)胞漿中的GAPDH 主要參與糖酵解代謝,產(chǎn)生能量(ATP)，以及通過對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，控制基因的表達(dá)。細(xì)胞核內(nèi)的GAPDH除了通過對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控來控制基因的表達(dá)外，還在DNA的復(fù)制, 遺傳信息的傳遞，以及DNA的修復(fù)以保持基因組的穩(wěn)定方面發(fā)揮作用[8]。

近年來GAPDH對寄生蟲的保護(hù)性免疫力的研究在國內(nèi)外受到關(guān)注, 多房棘球絳蟲GAPDH抗原性和保護(hù)性免疫力已被證實(shí)[9], 曼氏血吸蟲所衍生的42 kD GAPDH物種蛋白可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗血吸蟲尾蚴感染的保護(hù)性反應(yīng)[10]，閆玉濤等學(xué)者曾研究日本血吸蟲大陸株GAPDH基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠誘生的免疫應(yīng)答特征和保護(hù)性[11]。此外，GAPDH作為細(xì)粒棘球絳蟲糖酵解過程的關(guān)鍵酶，是抑制糖酵解過程的潛在靶標(biāo)，阻斷GAPDH的功能可以干擾蟲體賴以生存的碳水化合物和能量代謝，從而抑制寄生蟲的生長，所以目前GAPDH已成為研發(fā)抗寄生蟲藥物的重要靶標(biāo)[12]。國外文獻(xiàn)報道，AMP及其相似物可以在GAPDH催化3-磷酸甘油醛生成1，3-二磷酸甘油酸的反應(yīng)過程中對NAD+產(chǎn)生競爭性抑制，并以此來研究相關(guān)抗寄生蟲的藥物[13-18]。因此，對細(xì)粒棘球絳蟲GAPDH酶及其基因的深入研究，無論對于更全面了解細(xì)粒棘球絳蟲的生理代謝和致病作用，還是對新的抗細(xì)粒棘球絳蟲藥物的開發(fā)研究，都具有重要意義。

本研究首次克隆獲得了1 011 bp的細(xì)粒棘球絳蟲成蟲GAPDH基因全長cDNA序列，基于GAPDH基因的cDNA序列推測的蛋白質(zhì)序列長336個氨基酸。通過同源性分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)在進(jìn)化中高度保守。該蛋白包含2個保守區(qū)域，一個為NAD(P)結(jié)合功能域(aa4-159)，另一個為酶的催化區(qū)(aa156-314)，這說明該蛋白可能具有甘油醛3-磷酸脫氫酶相同的作用。

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