石 荔，董海燕，巴 桑，西 洛，索朗德吉,趙秀芹,萬康林

西藏是中國結核病疫情最嚴重的地區(qū)之一。本研究從來自西藏7個地區(qū)的藏族結核病患者中共分離出577株結核分枝桿菌，應用歐盟推薦的24位點MIRU-VNTR基因分型方法進行分子流行病學研究，并分析了24個VNTR位點的分辨率，旨在了解西藏藏族結核病患者中結核分枝桿菌的基因多態(tài)性、主要流行菌株以及現(xiàn)行的24位點MIRU-VNTR基因分型方法是否適合西藏藏族結核病患者的分子流行病學研究。

1 材料與方法

1.1菌株 自577例西藏藏族結核病患者分離出577株結核分枝桿菌臨床分離株，其中拉薩305株，日喀則80株，那曲49株，昌都46株，山南45株，林芝44株，阿里8株。由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳代培養(yǎng)、保存。

1.2結核分枝桿菌標準菌株H37Rv以及牛分枝桿菌BCG購自中國藥品生物制品檢定所，由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所傳代培養(yǎng)、保存。

1.3提取細菌DNA(CTAB法)[1]。

1.4位點選擇 從http://minisatellites.u-psud.fr/網(wǎng)站記載的結核分枝桿菌基因組多態(tài)性重復序列的位點引物序列，選擇歐盟推薦的24個VNTR位點(ETR-A、ETR-B、ETR-C、ETR-D(MIRU04)、ETR-E(MIRU31)、MIRU02、MIRU10、MIRU16、MIRU20、MIRU23、MIRU24、MIRU26、MIRU27、MIRU39、MIRU40、Mtub04、Mtub21、Mtub29、Mtub30、Mtub34、Mtub39、Qub26、Qub11-b及Qub4156c)。

1.5PCR反應體系及擴增 總體積為15 μL。即2×Taq Master Mix 7.5 μL，引物( 5 μmol/L) 各1.5 μL，DNA模板 2.5 μL，去離子水 2.0 μL。PCR預變性95 ℃，15 min；變性94 ℃，1 min；退火60 ℃，1 min；延伸72 ℃，1.5 min；35個循環(huán)。最后延伸72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存。

1.62%瓊脂糖凝膠電泳

1.7位點重復次數(shù)計算 通過DNA Marker和標準菌株H37Rv的VNTR位點重復單元的重復次數(shù)作標準參照，根據(jù)擴增片段大小利用BioNumerics5.0軟件計算出被測菌株各VNTR位點重復單元的重復次數(shù)。

1.8數(shù)據(jù)處理分析 實驗數(shù)據(jù)及結果數(shù)字化后用Excel錄入，登錄網(wǎng)站http://www.miru-vntrplus.org比對分析。應用BioNumerics5.0軟件對分型結果進行聚類分析。同時應用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.9Hunter-Gaston指數(shù)的計算，公式如下：

其中，N為菌株總數(shù)。S為總類型數(shù)，nj是第j類型的菌株數(shù)。

2 結 果

2.124個位點MIRU-VNTR基因多態(tài)性分析 將577株結核分枝桿菌MIRU-VNTR基因分型結果轉化成數(shù)字，用BioNumerics5.0軟件進行聚類分析(圖1)，577株結核分枝桿菌呈現(xiàn)出347種基因型，其中278株表現(xiàn)為獨特的基因型，另299株分為69個基因簇(2-37株菌)，成簇率為51.82%。對于所有分析的菌株，24位點的MIRU-VNTR分型方法的Hunter-Gaston指數(shù)是0.992。

2.224個MIRU-VNTR位點等位基因多態(tài)性分析 本研究選擇的24個VNTR位點中，Qub26位點有27株結核分枝桿菌沒有擴增產(chǎn)物；Qub11b位點有28株結核分枝桿菌沒有擴增產(chǎn)物；Qub4156c有21株結核桿菌沒有擴增產(chǎn)物；MIRU16位點有7株結核分枝桿菌沒有擴增產(chǎn)物；MIRU26位點有3株結核分枝桿菌沒有擴增產(chǎn)物。計算各位點的Hunter-Gaston指數(shù)(表1)，發(fā)現(xiàn)無論是對所有分析的菌株還是對北京家族菌株進行基因分型，MIRU31和Qub11b位點的分辨率很高(Hunter-Gaston指數(shù)≥0.6)，Qub26、 Qub4156c、Mtub21、MIRU26和MIRU20位點的分辨率適中(Hunter-Gaston指數(shù)≥0.3)，而其它位點的分辨率較差(Hunter-Gaston指數(shù)<0.3)[2]，尤其是MIRU24位點的Hunter-Gaston指數(shù)為0。

表1 24個VNTR位點對所有菌株及其中北京家族菌株的Hunter-Gaston指數(shù)分辨率

圖1577株結核分枝桿菌MLVA-24最小生成樹圖

每個圓形代表一種基因型，圓形的大小代表菌株數(shù)量的多少

Fig.1TheminimumspanningtreeofMLVA-24of577M.tuberculosis

Each circle represents a genotype and the size of the circular representative strains quantity.

2.3與數(shù)據(jù)庫的比對分析 將577株結核分枝桿菌的24個位點MIRU-VNTR分型結果在http://www.miru-vntrplus.orgMIRU-VNTRplus數(shù)據(jù)庫進行聚類分析，采用UPGAMA法，聚類分析結果顯示，西藏藏族結核分枝桿菌主要包括4個基因家族的菌株，分別為北京家族菌株、T家族菌株、CAS家族菌株和LAM家族菌株(圖2)。

圖2577株結核分枝桿菌MLVA結果與數(shù)據(jù)庫菌株聚類結果，黃色方框代表本研究中的菌株，白色方框代表數(shù)據(jù)庫中的菌株。

Fig.2ClusteringandMLVAresultsof577strainsofM.tuberculosistogetherwithdatabase.

The yellow boxes represent strains in this study and White Square on behalf of the strains in the database.

3 討 論

采用歐盟推薦的24位點MIRU-VNTR分型方法對577株結核分枝桿菌進行了分型，結果顯示577株結核分枝桿菌呈現(xiàn)出347種基因型。與MIRU-VNTRplus數(shù)據(jù)庫中的菌株進行比對分析，發(fā)現(xiàn)577株結核分枝桿菌可聚成4個基因簇。其中最大的一簇為北京家族菌株，含523株，占90.64%(523/577)。這與曾報道過的西藏地區(qū)北京家族占90.28%相一致[3]。進一步表明了西藏藏族結核病患者中的流行優(yōu)勢菌是北京家族菌。而在歐洲，北京家族菌株的比例為16%，在美國的比例為4%[4], 因此歐盟推薦的方法是否適用于北京家族菌株流行區(qū)的分型研究尚待進一步探討及評價。

歐盟之所以推薦使用24位點的MIRU-VNTR分型方法，是因為認為這些位點組合的分辨力與IS6110-RFLP相似。本研究中，其中7個VNTR位點(Qub11b、MIRU31、Qub26、 Qub4156c、Mtub21、MIRU26和MIRU20)對西藏藏族結核分枝桿菌的基因分型分辨率較高，其Hunter-Gaston指數(shù)均大于0.3，表明這7個位點的多態(tài)性較好，適用于對北京家族為主的結核分枝桿菌的基因分型。其它17個VNTR位點的基因多態(tài)性較差，其Hunter-Gaston指數(shù)小于0.3，表明這些位點不適用于對以北京家族為主的西藏藏族結核分枝桿菌進行基因分型。MIRU24位點相對保守，利用該位點可以區(qū)分古典型結核分枝桿菌(含有TbD1區(qū))和現(xiàn)代型結核分枝桿菌(不含有TbD1區(qū))[5]，MIRU24位點的重復次數(shù)≥2的菌株為古典型結核分枝桿菌，重復次數(shù)為1的菌株為現(xiàn)代型結核分枝桿菌。本研究中MIRU24位點的重復次數(shù)均為1，提示西藏藏族結核病患者中沒有發(fā)現(xiàn)古典型結核分枝桿菌，表明西藏是一個較現(xiàn)代的結核病的流行地區(qū)。MIRU26位點在北京家族菌株中的分辨指數(shù)為0.430，大于0.3，說明該位點適合北京家族菌株的分型研究。Rao KR等研究認為北京家族菌株在MIRU26位點具有7個重復片段，因此認為該位點可用于北京家族菌株的快速鑒定[6]。而本研究中北京家族菌株在MIRU26位點有出現(xiàn)7個重復片段，也有多于7個和少于7個重復片斷的菌株，一些非北京家族菌株在該位點也具有7個重復片段。從而表明了同一VNTR位點不同地區(qū)的北京家族菌株的重復次數(shù)不一樣，因此北京家族菌株的MIRU-VNTR分型具有多樣性。

本研究西藏藏族結核病患者結核分枝桿菌基因多態(tài)性，并且北京家族菌株為主要的流行菌株，24位點MIRU-VNTR分型方法在對北京家族菌株進行分型研究。其中的一些位點的分型效果較差。這與日本的研究結果一致，并且日本也提出了適合北京家族菌株流行地區(qū)的12位點組合的VNTR分型方法[7]。由于不同地區(qū)的結核分枝桿菌的基因多態(tài)性及主要流行菌株并不相同，而且不同地區(qū)的北京家族菌株也具有不同的VNTR型。因此在對不同地區(qū)的結核分枝桿菌進行分子流行病學研究時，要考慮不同的VNTR位點組合，必要時要加入新的VNTR位點以增加基因分型的分辨力。

參考文獻：

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石荔，楊敏，Pource C, 等. MLVA和Spoligotyping 用于西藏地區(qū)216株結核分枝桿菌臨床分離株的基因分型研究[J].中華微生物和免疫學雜志，2007，27：711-718.

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