桂 亮，王太洪，張弘偉，盧有勝

microRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)約22 nt的非編碼RNA通過(guò)與靶基因RNA的3’-UTR區(qū)5～8個(gè)堿基的完全或部分互補(bǔ)結(jié)合來(lái)負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[1-3]。microRNA在多種生物學(xué)過(guò)程中起作用，包括發(fā)育、分化、凋亡和癌癥等[4-6]，到目前為止，已經(jīng)有近400個(gè)人類miRNA被發(fā)現(xiàn)，并且推測(cè)人類中1/3的基因都受到miRNA的調(diào)控。目前研究認(rèn)為，miRNA可通過(guò)類似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程，是近年來(lái)腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居高不下。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與癌基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子等多種基因表達(dá)異常密切相關(guān)。近年來(lái)隨著miRNA研究的深入，結(jié)腸癌與miRNA的關(guān)系日益受到關(guān)注[7-8]。近來(lái)，有研究報(bào)道m(xù)iR-17～92簇在結(jié)腸癌組織中表達(dá)失調(diào)[9-10]，提示miR-17～92簇可能參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但是miR-17～92簇中各成員對(duì)結(jié)腸癌的作用及機(jī)制至今尚未闡明。本研究采用實(shí)時(shí)real-time PCR技術(shù)檢測(cè)miR-17人結(jié)腸癌組織的表達(dá)水平，初步探討miR-17異常表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本病區(qū)2012年1月至2013年6月收治的經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的50例結(jié)腸癌患者手術(shù)標(biāo)本。其中男32例，女18例，年齡29～88歲，平均57歲。每例標(biāo)本均有癌旁正常黏膜作為對(duì)照，所有患者術(shù)前均未行放、化療，手術(shù)切除標(biāo)本后立即放人液氮冷卻，再轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。

1.2 試劑材料 RNAiso Plus試劑、Reverse Transcription System試劑盒和SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自TaKara；miR-17和內(nèi)參snU6引物由南京凱基生物公司設(shè)計(jì)合成。

2 方法

2.1 RNA的提取 結(jié)腸癌組織及癌旁組織總RNA的提取采用RNAiso Plus試劑一步提取法，具體步驟參照說(shuō)明書，提取的總RNA置于-70 ℃保存。

2.2 轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 步驟參照說(shuō)明書，miR-17，U6使用特異性RT引物，反應(yīng)條件為42 ℃，15 min，85 ℃，5 s。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 20 μl反應(yīng)體系參照說(shuō)明書，在96孔熒光PCR儀(7300型，美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行擴(kuò)增．反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算得到各反應(yīng)管Ct值。通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，△△Ct=(Ct癌組織-Ct內(nèi)參)-(Ct癌旁組織-Ct內(nèi)參)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 miR-17在結(jié)腸癌組織及正常組織中的表達(dá) miR-17在結(jié)腸癌組織及正常組織中的表達(dá)見圖1，結(jié)腸癌組織中miR-17表達(dá)量較正常組織明顯降低(P<0.05)。

圖1 結(jié)腸癌與癌旁組織中miR-17的表達(dá)水平

3.2 miR-17的表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 具體數(shù)據(jù)見表1。如表1所示，miR-17表達(dá)下調(diào)與TNM分期以及浸潤(rùn)深度有關(guān)(均P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。

表1 miR-17的表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系

4 討論

本研究證實(shí)了miR-17在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，在癌旁組織中高表達(dá)，而且其表達(dá)變化與TNM分期以及浸潤(rùn)深度有關(guān)，而與腫瘤患者的性別、年齡、腫瘤的直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均沒(méi)有明顯相關(guān)性。這提示miR-17在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有抑癌基因的作用，miR-17可能直接參與調(diào)控早期腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)化。miR-17～92簇最早發(fā)現(xiàn)其在B淋巴細(xì)胞瘤[11]和肺癌[12]中高表達(dá)，是最早發(fā)現(xiàn)的具有癌基因作用的miRNA，因而被命名為“Onco miR-1”。與我們研究結(jié)果一致的是，有研究發(fā)現(xiàn)miR-17～92簇在乳腺癌、肝癌等由于所在染色體的雜合性缺失而出現(xiàn)表達(dá)量降低。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-17/20a可通過(guò)抑制AIB1、IL-8、CyclinD1等抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，從而扮演了抑癌基因的角色[13]。近來(lái)，有少量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-17～92簇參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[9]，Tavazoie等[14]研究發(fā)現(xiàn)在人結(jié)腸癌組織中miR-17～92簇的表達(dá)水平與其基因所在基因組的位點(diǎn)13q和c-myc表達(dá)密切相關(guān)，他們的研究結(jié)果顯示只有當(dāng)腫瘤組織中13q穩(wěn)定存在時(shí)，miR-17～92簇的表達(dá)水平明顯增加，而在13q缺失的腫瘤組織中則未檢測(cè)到miR-17～92簇的表達(dá)。而Tavazoie等的研究是隨機(jī)比較了人55例結(jié)腸癌組織和10例癌旁組織中miR-17～92簇的表達(dá)，因而研究并不能夠很好的反映腫瘤發(fā)生早期的miRNA表達(dá)譜變化。而在我們的研究中，我們?cè)诒容^了50例相互匹配的人結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-17～92簇的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)其在癌旁組織中明顯高表達(dá)，但其表達(dá)水平變化與腫瘤的進(jìn)展無(wú)明顯相關(guān),而且我們所檢測(cè)的標(biāo)本中大多數(shù)為早期腫瘤標(biāo)本。

綜上所述，本研究證實(shí)了miR-17在結(jié)腸癌組織表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)變化與TNM分期以及浸潤(rùn)深度有關(guān)，而與腫瘤患者的性別、年齡、腫瘤的直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均沒(méi)有明顯相關(guān)性。據(jù)此，我們推測(cè)miR-17可能在結(jié)腸癌發(fā)生早期具有重要的調(diào)控作用，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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