王彥強呂鵬飛張光武于明川田小雷劉正*

（北京大學首鋼醫(yī)院1.骨科，2.醫(yī)學影像中心，北京 100144）

人臍帶間充質干細胞移植修復兔退變椎間盤的初步研究

王彥強1呂鵬飛1張光武1于明川2田小雷2劉正1*

（北京大學首鋼醫(yī)院1.骨科，2.醫(yī)學影像中心，北京 100144）

?基礎研究?

0523

背景：大量研究證實，骨髓間充質干細胞在體外和體內均可向椎間盤樣細胞分化，并初步用于治療椎間盤退變。與骨髓間充質干細胞相比，人臍帶間充質干細胞（UCMSCs）具有明顯的優(yōu)勢：①成本較低；②來源豐富；③不會給捐獻者造成新的創(chuàng)傷和痛苦；④不涉及倫理問題；⑤可塑性強；⑥擴增能力強；⑦無致瘤活性和低免疫原性；⑧不會隨著傳代次數(shù)增加導致增殖能力和分化能力降低。

目的：探索UCMSCs修復椎間盤退變的可能性。

方法：體外培養(yǎng)UCMSCs，髓核抽吸法建立兔椎間盤退變模型，將UCMSCs移植到退變的兔椎間盤中，4、8、12周后行X線、MRI檢查，并取材行髓核蛋白多糖檢測，檢測修復效果。本實驗按照椎間盤節(jié)段分組，每只兔子的L2/3 為退變組，L3/4 為 PBS 注 射 組，L4/5 為 UCMSCs移植組 ，L5/6 為 空 白 對照組。 應 用 圖像處理軟 件 對 X 線 圖 像進行分 析 。 采用椎間盤高度指數(shù)（DHI）評估椎間盤高度變化。

結果：術后 4、8、12 周，退 變組與對照組相比 ，DHI%值和髓核蛋 白多糖含量明顯降 低，MRI T2WI分 級 明顯升高，且均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。UCMSCs移植組與 PBS 注射組比，DHI%值和髓核蛋白多糖含量有所升高，MRI T2WI分級有所降低，在術后12周時兩組比較具有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

結論：髓核抽吸法成功建立了兔椎間盤退變模型，移植UCMSCs可以有效修復兔椎間盤的退變。

間充質干細胞；椎間盤退變；細胞治療方法

Background:A large amount of researches confirmed that bone marrow mesenchymal stem cells is able to differentiate into intervertebral disc cells both in vitro and in vivo,and preliminarily used for the treatment of intervertebral disc degeneration. Compared with bone marrow mesenchymal stem cells,human umbilical cord mesenchymal stem cells(UCMSCs)have obvious advantages:low cost,wide sources,not causing new trauma and pain for the donor,not involving ethical issues,stronger plasticity and amplification ability,non-tumorigenic activity and low-immunogenicity,no decrease of proliferation ability or differentiation ability with passage number and body age increasing.

Objective:The purpose of the study is to evaluate whether injections of UCMSCs had regenerative effects on intervertebral disc degeneration in a rabbit model.

Methods:UCMSCs were cultured in vitro.Four continuous lumbar discs were injured by aspirating nucleus pulposus in rabbits to induce disc degeneration and then the rabbits were treated by injection with UCMSCs or phosphate buffered saline (PBS).At 4,8,and 12 weeks after initial injection,rabbits were performed by X-rays and magnetic resonance imaging (MRI),and ther they were sacrificed and the spine was extracted for detecting proteoglycan content.

Results:DHI(disc height index)and proteoglycan content showed significantly lower in the degenerated group as compared with the control group,while the MRI grade showed the opposite change at 4,8,and 12 weeks after initial injection(P< 0.05).DHI and proteoglycan content in the UCMSCs-injected group were significantly higher than those in the PBS-injected group at 12 weeks after injection,but the MRI grade showed the opposite change(P<0.05).

Conclusions:The results of our study indicate that UCMSCs is a promising candidate for the treatment of the degenerative disc disease.

骨科疾病中，下腰痛是常見的臨床癥狀，且發(fā)生率在不斷增加[1]。在下腰痛的發(fā)病過程中椎間盤退變是最主要的原因[2]。目前，臨床上治療椎間盤退變的方法只是緩解癥狀而非針對退變的原因。利用組織工程學方法修復椎間盤退變，恢復椎間盤功能的治療方法正成為研究的熱點。人體間充質干細胞可以分化為髓核樣細胞，為椎間盤組織工程提供了種子 細 胞 ，其 中 人 臍 帶 間 充 質 干 細 胞（umbilical cord mesenchymal stromal cells，UCMSCs）由 于 具 有 來 源充足、便于收集及其自身的前軟骨細胞特征的優(yōu)點而備受關注。本實驗通過將UCMSCs移植到兔退變椎間盤的模型中，觀察其對椎間盤退變的修復效果，為以后應用于臨床奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑和儀器

人臍帶間充質干細胞由北京英默生物科技有限公 司 提 供 ；DMEM、青 霉 素-鏈 霉 素(HyClone)；PBS（Sigma）；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（Gibco）；木瓜蛋白酶（eBioscience公司）；甘氨酸、氯化鈉、鹽酸、二甲基亞甲藍16m（Sigma）。

1.2 實驗動物

普通級新西蘭大白兔，購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，兔齡平均為 6個月，體重2.5～3 kg。

1.3 實驗方法

UCMSCs的 體 外 培 養(yǎng) ：取 第 2 代 凍 存 的 UCMSCs，復蘇后接種于含低糖完全培養(yǎng)基（含有10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的低糖DMEM 細胞培養(yǎng)液）的T-25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)為 5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每隔3 天更換一次培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數(shù)量，長滿90%左右時，胰酶消化、傳代，準備數(shù)量充足的細胞以供后續(xù)實驗使用。

動物模型建立和UCMSCs移植：氯胺酮和速眠新注射液體積比 1∶1 混合后肌內注射麻醉（0.8 ml/kg），左側臥位，手術區(qū)備皮、消毒、鋪單，從第12肋下緣至右髂前上嵴作長約 10 cm 的縱切口，逐層分離，顯露L2/3、L3/4、L4/5、L5/6 椎間盤；1 ml注射器刺入 L2/3、L3/4、L4/5 椎間盤約 5 mm，負壓抽吸髓核，L3/4 椎間盤注入等量 PBS溶液，L4/5椎間盤注入用 PBS 溶液重懸 P4 代的 UCMSCs 100 μl，細胞濃度為 2×106/ml，分層縫合肌肉皮膚組織。待實驗動物蘇醒后送回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，術后每天肌內注射青霉素8萬單位，連續(xù)注射 3 d，預防切口感染。

分組：本實驗分組是按照椎間盤節(jié)段設定的，即每只兔子的 L2/3 為退變組，L3/4 為 PBS 注射組，L4/5為 UCMSCs移植組 ，L5/6 為 對照組。不同實驗時間點符合條件的兔子4～5只。

X線檢查：分別于術前和術后4、8、12周對實驗動物麻醉后行正側位X線檢查，嚴格掌握麻醉藥劑量及麻醉時間，以控制肌肉緊張程度對椎間盤高度的影響。應用圖像處理軟件 Image J，對 X 線圖像進行分析。首先，在X線片上找出要測量的椎間盤，視其為長方形，量出長方形的2個寬，計其之和為A；再找出要測量的椎間盤的上位椎體，視其為長方形，量出長方形的2個長，計其之和為B；A/B即為椎間盤高度指數(shù)（DHI），使用 DHI%（DHI%=術后某時點 DHI/術前DHI）評估椎間盤高度變化。

MRI檢測：分別于術前和術后4、8、12周對實驗動物麻醉后取俯臥位行腰椎矢狀面T2加權像掃描。檢測采用頸椎正交線圈，重復時間（TR）3400 ms，回波時間（TE）130 ms，層厚 3 mm，層間距 1 mm。采用改良Thompson 分級法作為評估標準，評估術前及術后不同時間點不同組別髓核的退變程度。椎間盤退變分為4級：1級，髓核信號強度正常；2級，髓核信號強度輕度減弱，高信號區(qū)域明顯縮?。?級，髓核信號強度中度減弱；4級，髓核信號強度重度減弱。

蛋白多糖的測定：分別將術前和術后4、8、12周的實驗動物處死，取各個組別的髓核組織，55℃下用20 mmol/L 木瓜蛋白酶（含 5 mmol/L 乙二胺四乙酸，5 mmol/LN-乙酰-L-半胱氨酸溶液）消化髓核組織 24 h，取 25 μl髓核組織消化液與 125 μl二甲基亞甲藍（甘氨酸 3 g，氯化鈉 2.3 g，0.1 mol/L 鹽酸 100 ml，二甲基亞甲藍 16 mg）混合，用分光光度計測量 530 nm 波長處OD值，用硫酸軟骨素A作為標準品制作標準曲線，DMMB染色分光光度法測定髓核蛋白多糖含量變化。

1.4 統(tǒng)計學分析

實 驗 數(shù) 據(jù) 以 均 數(shù) ± 標 準 差 表 示 ，使 用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，DHI%和蛋白多糖含量組間差異比較采用t檢驗，MRI分級評分采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)觀察

細胞接種 6～8 h 后即可貼壁，呈散在分布、長梭形或扁平狀的成纖維樣細胞，密度增加時，細胞形態(tài)變得細長，呈旋渦狀生長（圖1）。

圖1 UCMSCs傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)（40×）

2.2 X 線檢查結果

在術后各個時間點，與對照組相比，退變組和PBS 注 射 組 的 DHI% 值 明 顯 降 低（P<0.05）；而 UCMSCs移植組的 DHI%值與PBS 注射組相比升高，在術后 12 周時兩組的 DHI%值有統(tǒng)計學差異（P<0.05）見圖2。

圖2 各組術前及術后DHI%的變化情況

2.3 MRI 檢查結果

各個時間點的 MRI T2WI圖像顯示，對照組椎間盤信號強度基本保持不變，退變組和PBS注射組椎間盤信號強度隨時間逐漸下降，UCMSCs移植組椎間盤信號強度比退變組和PBS注射組椎間盤信號強度有所升高（圖 3）。MRI T2WI分級結果顯示，術后4、8、16 周退變組與對照組相比 MRI T2WI分級明顯升 高（P<0.05），UCMSCs移 植 組 與 PBS 注 射 組 比MRI T2WI分級降低，且在 12 周時有統(tǒng)計學差異（P< 0.05）。詳見圖4。

2.4 蛋白多糖含量測定結果

術后4、8、16周退變組與對照組相比蛋白多糖含量明顯降低（P<0.05），UCMSCs移植組與PBS注射組相比蛋白多糖含量有所上升，在術后12周時兩組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。詳見圖 5。

圖 3 各組術前及術后 MRI T2WI圖像變化情況

3 討論

圖 4 各組術后 MRI T2WI分級變化情況

圖5 各組術后蛋白多糖含量變化情況

椎間盤退變引起的下腰痛是臨床上的常見癥狀，目前的各種治療方法只能緩解癥狀。隨著人們對椎間盤退變生物學改變的廣泛研究[3]，新的治療方法被不斷提出[4,5]。髓核細胞、軟骨細胞以及間充質干細胞[6,7]已經(jīng)被用于動物實驗研究。間充質干細胞根據(jù)所處環(huán)境可分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[8]。Sakai等[9]研究發(fā)現(xiàn)骨髓來源的自體干細胞可以增殖并分化成為表達髓核細胞表面標志的細胞。近來的研究表明，UCMSCs的收集過程無組織損傷，來源充足，具有更強的軟骨分化能力[10]，被認為是修復椎間盤退變的最佳選擇。Ruan 等[11]將 UCMSCs 與髓核細胞在體外進行共培養(yǎng)后，UCMSCs可以向髓核樣細胞分化。和UCMSCs組織來源相同的人臍帶血間充質干細胞被注射到體外培養(yǎng)的兔椎間盤后可以存活并能夠向軟骨樣細胞分化[12]。本實驗采用髓核抽吸法建立兔椎間盤退變模型，并將UCMSCs移植到退變椎間盤中，通過影像學檢查和髓核蛋白多糖含量檢測，結果顯示術后4、8、12周退變組與對照組相比，DHI%值和髓核蛋白多糖含量明顯減低，MRI T2WI分級 明顯 升高 ，且 均有 統(tǒng)計 學差 異；UCMSCs移植組與PBS 注射組比，DHI%值和髓核蛋白多糖含量有所升高，MRI T2WI分級有所降低，12 周時具有統(tǒng)計學差異。這就初步表明髓核抽吸法成功建立了椎間盤退變的模型，UCMSCs的移植可以有效修復椎間盤的退變。同時，本實驗還存在以下問題：第一，在評估椎間盤退變和修復的指標中，沒有進行組織學觀察，沒有看到椎間盤退變和修復的形態(tài)學改變。第二，在椎間盤退變的造模過程中，開放性手術容易刺激椎旁的韌帶，從而造成椎間盤周圍骨贅的形成，不利于后續(xù)的生物學治療。目前“C”型型臂引導下的纖維環(huán)穿刺技術發(fā)展迅速[13]，可以克服開放性手術的缺點。第三，本實驗的細胞移植屬于異種移植，雖然以前的研究表明，來源于骨髓、脂肪和肝臟的間充質干細胞具有免疫抑制作用[14]，實驗研究過程中也沒有發(fā)現(xiàn)排斥反應，但在以后的實驗中值得進一步研究。

[1]Hershkovich O,Friedlander A,Gordon B,et al.Associations of body mass index and body height with low back pain in 829,791 adolescents.Am J Epidemiol,2013,178 (4):603-609.

[2]Samartzis D,Karppinen J,Mok F,et al.A population-based study of juvenile disc degeneration and its association with overweight and obesity,low back pain,and diminished functional status.J Bone Joint Surg Am,2011,93(7):662-670.

[3]Kepler CK,Ponnappan RK,Tannoury CA,et al.The molecular basis of intervertebral disc degeneration.Spine J,2013, 13(3):318-330.

[4]Abbushi A,Endres M,Cabraja M,et al.Regeneration of intervertebral disc tissue by resorbable cell-free polyglycolic acid-based implants in a rabbit model of disc degeneration. Spine(Phila Pa 1976),2008,33(14):1527-1532.

[5]Chujo T,An HS,Akeda K,et al.Effects of growth differentiation factor-5 on the intervertebral disc--in vitro bovine study and in vivo rabbit disc degeneration model study. Spine(Phila Pa 1976),2006,31(25):2909-2917.

[6]Sakai D,Mochida J,Yamamoto Y,et al.Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc:a potential therapeutic model for disc degeneration.Biomaterials,2003,24(20):3531-3541.

[7]Yang X,Li X.Nucleus pulposus tissue engineering:a brief review.Eur Spine J,2009,18(11):1564-1572.

[8]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[9] Sakai D,Mochida J,Iwashina T,et al.Differentiation of mesenchymal stem cells transplanted to a rabbit degenerative disc model:potential and limitations for stem cell therapy in disc regeneration.Spine(Phila Pa 1976),2005,30 (21):2379-2387.

[10]Wang L,Tran I,Seshareddy K,et al.A comparison of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells for cartilage tissue engineering.Tissue Eng Part A,2009,15 (8):2259-2266.

[11]Ruan D,Zhang Y,Wang D,et al.Differentiation of human Wharton's jelly cells toward nucleus pulposus-like cells after coculture with nucleuspulposus cells in vitro.Tissue Eng Part A,2012,18(1-2):167-175.

[12]Anderson DG,Markova D,An HS,et al.Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in the cultured rabbit intervertebral disc:a novel cellsource for disc repair. Am J Phys Med Rehabil,2013,92(5):420-429.

[13]Kwon YJ.A minimally invasive rabbit model of progressive and reproducible disc degeneration confirmed by radiology,gene expression,and histology.J Korean Neurosurg Soc,2013,53(6):323-330.

[14]Jorgensen C.Mesenchymal stem cells immunosuppressive properties:is it specific to bone marrow-derived cells? Stem Cell Res Ther,2010,1(2):15.

Apreliminary study of transplant ation of human umbilical cord mesenchymal stem cell in a rabbit mode l of inte rvertebral disc degeneration

WANG Yanqiang1,LV Pengfei1,ZHANG Guangwu1,YU Mingchuan2,TIAN Xiaolei2,LIU Zheng1*
(1.Medical Imaging Center,2.Department of Orthopedics,Shougang Hospital,Peking University,Beijing 100144,China)

Mesenchymal stem cells;Intervertebral disc degeneration;Cell therapy

1674-1439（2014）06- -04

10.3969/j.issn.1674-1439.2014.06-017

*通信作者：劉正，E-mail:lz301198@aliyun.com