門翼君，馬順高，秦紅群

（1. 大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大理 671000；2. 云南省大理州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，大理 671000）

原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC）是一種病因不明，以肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞進(jìn)行損傷為主要特征的自身免疫性疾病。多見于中年女性。病理學(xué)特點(diǎn)為非化膿性的小葉間膽管炎、匯管區(qū)淋巴細(xì)胞聚集甚至形成淋巴濾泡，有非干酪樣肉芽腫形成，最終小葉間膽管消失，可導(dǎo)致肝細(xì)胞破壞、肝纖維化、肝硬化和肝衰竭[1,2]。其臨床診斷主要是根據(jù)臨床表現(xiàn)，生化指標(biāo)，自身抗體檢測(cè)以及病理學(xué)檢查。PBC患者的臨床表現(xiàn)主要為疲乏無力，瘙癢，黃疸，其臨床表現(xiàn)缺乏特異性。PBC診斷根據(jù)2009年歐洲肝病學(xué)會(huì)和美國(guó)肝病學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3,4]，符合以下3項(xiàng)中的至少2項(xiàng)：（1）堿性磷酸酶大于2倍正常值上限或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶大于5倍正常值上限，（2）抗線粒體抗體或抗線粒體抗體M2亞型陽性，（3）特征性小膽管損害的病理學(xué)改變。病理學(xué)改變的確診需要進(jìn)行肝活檢，其操作危險(xiǎn)性也較高，所以病人對(duì)于病理活檢接受程度較差，而在對(duì)沒有肝臟疾病臨床表現(xiàn)的PBC患者的長(zhǎng)期隨訪觀察顯示，相關(guān)的自身抗體可在PBC開始出現(xiàn)臨床癥狀的幾年甚至十幾年之前在患者的血清中被檢測(cè)到[5]。故自身抗體檢測(cè)在早期診斷PBC有著重要意義。本文就自身抗體檢測(cè)在診斷PBC的研究進(jìn)展作以綜述。

1 抗核抗體（Antinuclear antibodies, ANA）的檢測(cè)

ANA是一種廣泛存在于血清中的抗體，可見于多種自身免疫性疾病，而在健康老年人中也可見低滴度抗核抗體[6]。ANA是診斷PBC的重要標(biāo)志之一。ANA檢測(cè)方法有很多種，醫(yī)院中常用的方法為間接免疫熒光法，免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法。作為PBC的初篩實(shí)驗(yàn)，我們一般采用間接免疫熒光法，間接免疫熒光法具有快速，價(jià)格較低等優(yōu)勢(shì)。通過間接免疫熒光法檢測(cè)ANA在PBC患者中可出現(xiàn)多種熒光核型，如核膜型，核點(diǎn)型，細(xì)胞胞漿型和著絲點(diǎn)型。據(jù)國(guó)內(nèi)劉紅虹等[7]對(duì)123例PBC患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了分析，54例ANA陽性的PBC患者中，有33例為核膜型，約占61%。血清AMA檢測(cè)在PBC患者中的陽性率可以達(dá)到90%～95%，是診斷PBC的重要免疫學(xué)指標(biāo)。然而仍有5%～10%的PBC患者因AMA檢測(cè)陰性而被延誤診斷與治療。故相關(guān)的ANA檢測(cè)對(duì)AMA陰性的PBC患者的診斷十分關(guān)鍵。

1.1 抗-核包膜蛋白gp210

抗gp210抗體是一種抗核包膜蛋白抗體，為診斷PBC的高度特異性抗體?？筭p210抗體在PBC患者的特異性可高達(dá)99% ，但敏感性僅為10%～41%[8]。抗gp210抗體的熒光染色型為核膜型。抗gp210抗體的靶抗原為位于核孔復(fù)合物上的210kD跨膜糖蛋白，其所識(shí)別的表位是gp210羧基末端上15個(gè)氨基酸殘基。國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，抗gp210抗體也存在于20%～47%的AMA陰性PBC患者中。這對(duì)于AMA陰性的PBC患者的早期診斷至關(guān)重要。相關(guān)文獻(xiàn)表示，抗gp210抗體還可提示疾病預(yù)后[10]，其陽性的PBC患者與陰性者相比，更容易發(fā)展為肝衰竭，說明抗gp210抗體還可以作為PBC患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，對(duì)患者的進(jìn)展及預(yù)后的判斷具有重要價(jià)值。

1.2 抗-可溶性酸性磷酸化核蛋白Sp100

spl00是一種核蛋白，是一種分子量100kDa的可溶性酸性磷酸化核蛋白質(zhì)，點(diǎn)狀分布于細(xì)胞核內(nèi)?？筭p210抗體的熒光染色型為多核點(diǎn)模型。spl00抗體診斷PBC特異性較高，尤其在大部分AMA陰性PBC患者血清中可被檢測(cè)到。國(guó)外相關(guān)研究[11,12]顯示，抗核點(diǎn)抗體sp100不僅對(duì)PBC診斷特異性高，可達(dá)到為97%[13]，且對(duì)疾病監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷很有價(jià)值[14]，Muratori等[12]報(bào)道，老年人更容易表達(dá)spl00抗體。據(jù)國(guó)內(nèi)潘盈等人的研究[15]表示，該抗體陽性的PBC患者出現(xiàn)肝硬化的幾率顯著增高，血清中膽紅素升高，患者病情進(jìn)展速度快，預(yù)后較差。說明抗SP100抗體對(duì)于PBC患者疾病的進(jìn)展與預(yù)后有著十分重要的意義。然而抗sp100抗體對(duì)于診斷PBC的敏感性較低，我們可以進(jìn)行多種自身抗體的聯(lián)合檢測(cè)，將抗gp120抗體與抗sp100抗體、AMA進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，從而同時(shí)提高診斷PBC的特異性和敏感性。

1.3 抗著絲點(diǎn)抗體（Anticentromere antibodies, ACA）

ACA的靶抗原是著絲點(diǎn)蛋白A、B和C，其中著絲點(diǎn)蛋白B是最主要的靶抗原。ACA不僅可見于硬皮病，其在PBC患者血清中也有較高的陽性率。史旭華等[16]人研究顯示，ACA在PBC患者中的陽性率為53.5%，尤其是高滴度的ACA，可作為PBC的另外一種免疫學(xué)標(biāo)志。Nakamura等[17]研究顯示，ACA陽性PBC患者與ACA陰性患者相比。門靜脈高壓表現(xiàn)更為突出.。ACA陽性代表的門脈高壓型PBC患者的臨床特點(diǎn)為無進(jìn)展性黃疸的靜脈曲張。

1.4 其它抗核抗體

抗PML抗體是快速診斷急性早幼粒細(xì)胞白血病的重要免疫學(xué)標(biāo)志，但也可見于PBC患者血清中。國(guó)外相關(guān)研究[18]顯示，約19%的PBC患者血清中可檢測(cè)到抗PML抗體，并且抗PML抗體和抗sp100抗體經(jīng)常相伴出現(xiàn)。

抗釀酒酵母菌抗體（Anti-Saccharomyces cerevisiae Antibodies，ASCA）是針對(duì)釀酒酵母菌細(xì)胞壁甘露聚糖成分的一種抗體。既往研究報(bào)道顯示，ASCA主要見于克羅恩病患者血清中，是克羅恩病患者血清中的特異性自身抗體[19]。該抗體還可見于乳糜泄[20]等多種自身免疫性疾病患者的血清中。ASCA分為IgA和IgG兩種亞型，根據(jù)國(guó)內(nèi)胡朝軍等人的研究[21]顯示ASCA-IgA在PBC患者中的陽性率為24.2%，ASCA-IgG在PBC患者中的陽性率為13.6%，在PBC患者ASCA不同亞型的陽性和陰性組與肝功能分析結(jié)果顯示ASCA-IgA與PBC患者的病情發(fā)展密切相關(guān)，較ASCA-IgG在PBC中有更重要的臨床意義。ASCA是PBC患者血清中存在的自身抗體，并且ASCA在中國(guó)人群的PBC患者中陽性率高于國(guó)外的文獻(xiàn)報(bào)道。

抗p62抗體，抗板層素抗體與抗LBR抗體均屬于抗核包膜蛋白抗體。抗p62抗體又稱抗核心蛋白抗體，抗p62抗體的靶抗原是位于核孔復(fù)合物上的62 kDa跨膜蛋白，LBR抗體又稱抗核板層B受體抗體，LBR抗體的靶抗原是由60個(gè)氨基酸組成的核內(nèi)膜多肽蛋白，李永哲等[22]研究顯示通過ELISA檢測(cè)PBC患者血清結(jié)果顯示，抗p62抗體與抗LBR抗體陽性率分別為30.9%和5.9%。但抗p62抗體與抗LBR抗體僅在PBC患者血清中檢測(cè)出，其特異性為100%。其極高的特異性提示抗p62抗體與抗LBR抗體可能與疾病的病理生理過程有關(guān)?？拱鍖铀乜贵w又稱抗核纖層抗體，并不是PBC患者血清中特有的自身抗體，能在多種疾病患者血清中檢測(cè)到如自身免疫性肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。根據(jù)靶抗原不同分為抗板層素A抗體、抗板層素B、抗體和抗板層素C 抗體三種亞型。一般情況下，PBC患者血清中能檢測(cè)到抗板層素抗體A和C，抗板層素抗體的臨床意義有待于深入研究。

2 抗線粒體抗體（Antimitochondrial antibody, AMA）檢測(cè)

AMA是一種以線粒體為靶抗原，無種屬和器官特異性的自身抗體，主要針對(duì)線粒體兩層生物膜蛋白。該抗體主要是IgG。線粒體存在于多種組織細(xì)胞胞漿中，故其熒光模型為胞漿顆粒型。線粒體的靶抗原位于線粒體內(nèi)外膜，AMA作為一種自身抗體可進(jìn)入細(xì)胞，直接與線粒體靶抗原發(fā)生中和作用，導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷[23]。1965 年Walker 等[24]首次采用間接免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中存在一種物質(zhì)，經(jīng)鼠肝線粒體預(yù)處理后可阻斷這種間接免疫熒光反應(yīng)，證實(shí)該物是AMA。

AMA是診斷PBC最重要的特異性抗體，將近95%的PBC患者AMA陽性[25]。此抗體的出現(xiàn)可早于臨床癥狀出現(xiàn)前若干年，具有十分重要的早期診斷價(jià)值。根據(jù)線粒體內(nèi)外膜上能與AMA反應(yīng)的9種自身抗原，將AMA分為9 種亞型（Ml～M9），不同的亞型其臨床意義存在差異，與PBC診斷相關(guān)的是M2、M4、M8 和M9亞型。

2.1 AMA-M2抗體檢測(cè)

AMA-M2是目前輔助診斷PBC主要檢查項(xiàng)目。AMA-M2對(duì)PBC檢測(cè)的敏感性達(dá)93%以上，特異性幾乎為100%[26]。AMA-M2的靶抗原主要是線粒體內(nèi)膜上的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDC-E2）、酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(OGDC-E2)和支鏈二氧酸脫氫酶復(fù)合體(BCOADC-E2)。

AMA-M2的主要檢測(cè)方法有：間接免疫熒光法、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，不同方法的敏感性和特異性不同。間接免疫熒光法是檢測(cè)AMA-M2的經(jīng)典檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[26]表明根據(jù)其滴度水平越高，對(duì)PBC診斷更具意義，但AMA-M2抗體滴度水平與疾病嚴(yán)重程度之間無相關(guān)性。但是其結(jié)果判斷主要依賴于檢驗(yàn)人員的熟悉程度，尤其當(dāng)AMA滴度較低時(shí)容易造成漏診。而免疫印跡法與ELISA可將三個(gè)靶抗原PDC—E2、OGDC-E2和BCOADC-E2與天然M2抗原形成的復(fù)合體（M2-3E/BPO）作為檢測(cè)抗原，國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)[27]報(bào)道，對(duì)于3個(gè)靶抗原的檢測(cè)重組成的三聯(lián)體蛋白，使其診斷PBC的敏感性和特異性都會(huì)升高。82%的PBC患者血清皆與這個(gè)三聯(lián)體抗原反應(yīng)，在正常人群中卻沒有與該抗原反應(yīng)的抗體[28]。這表明M2-3E 對(duì)PBC 的診斷有較強(qiáng)的特異性。

國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[29,30]表明，AMA-2，AMA-4，AMA-9聯(lián)合檢測(cè)在診斷PBC中的意義并不優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)AMA-M2,而檢測(cè)的成本明顯增高。

2.2 AMA-M4抗體檢測(cè)

AMA-M4所針對(duì)的抗原是亞硫酸氧化酶（PDC-E1），AMA-M4是分子量為52 kDa 的單抗原。統(tǒng)計(jì)既往國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[30～32]顯示該抗體陽性率在42.6%～53.3%?，F(xiàn)為AMA-M4是一個(gè)重要的判斷病情程度的抗體，提示疾病處于進(jìn)展期，或者是病人病情較重、預(yù)后不佳[33]。因此對(duì)M2亞型陽性患者可再做M4亞型檢測(cè)，以作判斷病情進(jìn)展。

2.3 AMA-M8抗體檢測(cè)

AMA-M8針對(duì)的抗原位于線粒體外膜。AMA-M8只與AMA-M2同時(shí)出現(xiàn)，但并非所有AMA-M2陽性時(shí)都出現(xiàn)ANAM8陽性。若AMA-M2，AMA-M4，AMA-M8的同時(shí)存在PBC患者血清中，可說明疾病處于活動(dòng)期。

2.4 AMA-M9抗體檢測(cè)

AMA-M9針對(duì)的抗原為糖原磷酸化酶(胞漿酶)，包含四個(gè)分子量為98kDa的亞單位[34]。歐蒙公司質(zhì)控顯示M9亞型抗體在PBC病人的陽性率為9%～37%。AMA-M9可于AMAM2陰性的PBC患者血清中檢測(cè)呈陽性。Klein等[35]研究認(rèn)為與AMA-M4相反，AMA-M9被認(rèn)為是提示處于病情早期或病情預(yù)后樂觀的抗體，AMA的分型能夠提示預(yù)后。而Joshi等[36]則認(rèn)為AMA的分型對(duì)于估計(jì)預(yù)后是否樂觀沒有幫助，Vleggaar等[37]也認(rèn)為AMA的分型沒有預(yù)后意義。

綜上所述，自身抗體檢測(cè)不僅在早期診斷PBC上有著重要意義，對(duì)PBC疾病進(jìn)展，疾病分期，治療以及預(yù)后也有著不可缺少的作用。隨著方法的不斷改進(jìn)，研究的不斷深入，越來越多新的與PBC相關(guān)的自身抗體會(huì)被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)提高對(duì)于PBC的特異性和敏感性，從而成為新的免疫學(xué)指標(biāo)。

[1] Keith D, Lindor M, Eric G,et al.Primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study Liver Diseases practice guidelines. J Hepatol, 2009, 50 (1) : 291-308.

[2] Lleo A, Invernizzi P, Gershwin M E,et al.Etiopathogenesis of primary biliary cirrhosis. World J Gastroenterol, 2008, 14(21): 3328.

[3] European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines: management of cholestatic liver diseases. 2009,51: 237-267.

[4] Lindor K D, Gershwin M E, Poupon R,et al.primary biliary cirrhosis. Hepatology, 2009, 50: 291-308.

[5] Metcalf J V, Mitchison H C, Palmer J M,et a1.Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet, 1996, 348: 1399-1402.

[6] 汪蘭蘭.臨床免疫學(xué). 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2005:168.

[7] 劉紅虹, 福軍亮, 徐軍, 等. 123例原發(fā)性膽汁性肝硬化臨床表現(xiàn)與自身抗體譜. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）2013, 45(2) : 233-237.

[8] Muratori L, Granito A, Muratori P,et a1.Antimitoehondrial antibodies and other antibodies in primary biliary cirrhosis: diagnostic and prognostic value. Clin Liver Dis, 2008, 12(2): 261-276．

[9] Muratori P, Muratori L, Ferrari R,et a1.Characterization and clinical impact of an tinuelear antibodies in primary biliary cirrhosis.Am J Gastroenterol, 2003, 98(2): 431437．

[10] Nakamura M, Shimizu Y Y, Takii Y,et a1.Antibody titer to gp210-C terminal peptide as a clinical parameter for monitoring primary biliary cirrhosis. J Hepatol, 2005, 42(3): 386-392．

[11] Granito A, Muratori P, Quarneti c,et a1.Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis. Expert Rev Mol Diagn, 2012, 12: 65-74．

[12] Muratori P, Muratori L, Cassani F,et a1.Anti-multiple nuclear dots (anti-MND)and anti-SPl00 antibodies in hepatic and rheumatological disorders. Clin Exp lmmtmol, 2002, 127: 172-175.

[13] Muratori P, Muratori L, Ferrari R,et al.Characterization and clinical impact of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis.Gastroenterol, 2003, 98(2): 431-437.

[14] Czaja A J. czaja autoantibodies as prognostic markers in autoimmune liver disease. Dig Dis Sci, 2010, 55: 2144-2161．

[15] 潘盈, 史旭華, 張?jiān)? 等. 原發(fā)性膽汁性肝硬化自身抗體特征及其對(duì)藥物治療的反應(yīng). 中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志, 2009, 3: 178-183.

[16] 史旭華, 張奉春, 張烜. 抗著絲點(diǎn)抗體在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的意義. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2006, 10(8): 485-487.

[17] Nakamura M，Kondo H，Mori T，et a1.Anti-gp210 and anticentromere antibodies are different risk factors for the progression of primary biliary cirrhosis. Hepatology, 2007, 45:118-127．

[18] Rivera M Y, Martínez F P, Tang Q. Nuclear domain 10 of the viral aspect. World J Virol, 2013, 2(3): 110-122.

[19] Forcione D G, Rosen M J, Kisiel J B,et al.Anti- Saccharomyces cerevisiae antibody(ASCA) positivity is associated with increased risk for early surgery in Crohn’s disease.Gut, 2004, 53: 1117-1122.

[20] Toumi D, Mankaio A, Belhadj R,et al.Anti-Saccharomyces cerevisiae Antibodies in coeliac disease. Scand J Gastroenterol,2007, 42: 821-826.

[21] 胡朝軍. 原發(fā)性膽汁性肝硬化血清標(biāo)志物的篩選及ASCA在PBC中的臨床意義. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2010, 5.

[22] 李永哲, 劉鐳, 孫慶國(guó), 等. 核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗原基因克隆表達(dá)及其抗體診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化的價(jià)值初探.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 28(11): 1120-1125.

[23] 彭衛(wèi)華, 譚立明, 陳建華, 等. 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者特異性自身抗體的實(shí)驗(yàn)研究. 山東醫(yī)藥, 2012, 52(44): 17-19.

[24] Walker J G, Doniach D, Roitt I M,et al.Serological tests in diagnosis of primary biliary cirrhosis. Lancet, 1965, 1(7390): 827-831.

[25] Karlsen T H, Vesterhus M, Boberg K M. Review article:controversies in the management of primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis. Aliment Pharmacol Ther, 2014,39(3): 282-301.

[26] 杜慧慧, 李青梅, 周希禛, 等. 多種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的診斷價(jià)值. 中國(guó)肝臟病雜志(電子版), 2013, 5(1):l9-23.

[27] Braun S, Berg C, Buck S,et al.Catalytic domain of PDC-E2 contains epitopes recognized by antimitochondrial antibodies in primary biliary cirrhosis lab diagnosis. World J Gastroenterol, 2010,16(8): 973.

[28]Mayakawa H，Tanaka A，Kikuchi K，et al.Detection of antimitochondriaI autoantibodies in immunofluorescent AMA-negative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology, 2001, 34: 243-248．

[29] 張玲, 李玲, 李云珍, 等. 自身抗體在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的應(yīng)用價(jià)值. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(4): 496-497.

[30] 段東杰. 抗線粒體抗體亞型在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的診斷價(jià)值. 中國(guó)醫(yī)療前沿(上半月), 2009, 4(1): 7-8.

[31] 馮雪, 李永哲, 張洋, 等. 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者抗線粒體抗體亞型檢測(cè)的臨床意義. 標(biāo)記免疫分析與臨床, 2008, 15(5): 265-267.

[32] 李忻. 血清抗線粒體抗體亞型檢測(cè)對(duì)PBC患者的診斷價(jià)值. 放射免疫學(xué)雜志, 2012, 25(1): 63-65.

[33] Flisiak R, Pelszynska M, Prokopowicz D,et a1.High concentration of antimitoehondrial antibodies predicts progressive primary biliary cirrhosis. World J Gastroenterol, 2005, 11(36): 5706-5709．

[34] 王培之, 張黔英, 蘭孟東, 等. 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者自身抗體檢測(cè)的臨床意義. 臨床薈萃, 2006, 21(2): 103-105.

[35] Klein R, Pointner H, Zilly W,et a1.Antimitochondrial antibody profiIes in primary biliary cirrhosis distinguish at early stages between a benign and a progressive course: a prospective study on 200 patients followed for 10 years. Liver, 1997, 17: 119-128.

[36] Supriya J, Karen C D, Jenny E. Heathcote．Antimitochondrial Antibody Profiles：Are They Valid Prognostic Indicators in Primary Biliary Cirrhosis？Am J Gastroenterol, 2002, 97: 999-1002.

[37] Vleggaar F P, Van B H R. No prognostic significance of antimitochondrial antibody profile testing in primary in primary biliary cirrhosis. Hepato-gastroenterology, 2004, 51(58): 937-940.